HPV 2016: Exames de BIOLOGIA MOLECULAR EM MULHERES COM HPV(PAPILOMAVIRUS) – Interpretando o resultado 

Métodos para detecção:

  • SOUTHERN BLOT

É a técnica mais sensível e específica, considerada o “padrão ouro”. Fragmentos individuais de DNA são gerados por uma técnica de restrição através de digestão enzimática, separados em gel por eletroforese e transferidos a um filtro inerte. De acordo com o tamanhos do fragmentos, tipos específicos de HPV são reconhecidos após hibridização com sonda radioativa ou biotinilada. É usada em experimentos científicos.

  • DNA DOT BLOT

Nesta técnica, o DNA total é imobilizado em um suporte inerte por aplicação direta. Pode-se quantificar o DNA acuradamente e múltiplas amostras podem ser examinadas usando-se dispositivo de múltipla filtragem. A principal desvantagem é que se analisa o DNA total, e não fragmentos digeridos por restrição por endonucleases – não há como distinguir hibridizações cruzadas com outros ácidos nucleicos presentes na amostra. Usada em experimentos científicos.

  • HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

Esta técnica é executada em fragmentos de tecido, e permite um alto grau de localização espacial. Neste método, sondas virais são acopladas a biotina ou digoxigenina em vez de um radioisótopo como fósforo radioativo. A molécula de biotina é então detectada por uma série de reações citoquímicas que resultam na ligação de um complexo enzimático (avidina-peroxidase). Finalmente, a enzima pode ser visualizada devido a sua habilidade em converter um substrato incolor em um pigmento insolúvel marrom no sítio da formação do híbrido.
– realizada em material já biopsiado (bloco de parafina) – detecta a presença de vírus na lesão retirada. É portanto o método de escolha para confirmação da histologia.

  • PCR: AMPLIFICAÇÃO GÊNICA PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Um pequeno segmento de DNA é amplificado mais de 100.000 vezes pelo uso de primers de oligonucleotídeos complementares a fitas opostas de DNA. A sequência de DNA amplificada é então detectada por técnicas de hibridização usuais ou métodos mais avançados como ELISA.

Detecta níveis muito baixos de virions, apesar de 100 a 500 virions ser o costumeiro (carga viral na infecção produtiva: 50-200 cópias/célula; infecção não produtiva (transformadora): <20 cópias/célula)

  • CAPTURA HÍBRIDA

Esta técnica detecta uma sequência viral em meio a até dez células, podendo ser utilizada para identificar a presença de um vírus na lesão, ou, caso a lesão já tenha sido extirpada, verificar se persistem vírus na mucosa.

Indicações para pesquisa de HPV

– Discordância entre o exame citopatológico e a colposcopia, e/ou entre a citologia e o anatomopatológico

– Citologia positiva (HSIL) com posterior colposcopia e histologia negativa – em estudo de 328 casos, apenas 22% receberam diagnóstico de CIN subseqüente (evolução de 3 anos)

– CPHSIL+/AP-: se HPV+, cone ou acompanhar; se HPV-, tranqüilizar

Helberg et al: Positive cervical smear with subsequent normal colposcopy and histology – frequence of CIN in a long-term follow-up. Gynecol Oncol 53:148-151, 1994.

– Mulheres com lesões acetobrancas que são HPV positivas, porém histologicamente equívocas, podem não ter padrões diagnósticos de HPV devido a fatores imunes do hospedeiro, à natureza transitória da lesão ou à amostragem inadequada

Nuovo et al: HPV detection in cervical lesions nondiagnostic for CIN: Correlation with Papanicolaou smear, colposcopy, and ocurrence of CIN. Obstet. Gynecol 75:1006-1011, 1990.

– Acompanhamento (triagem) de ASCUS

– Controle com CP é subótimo: o potencial de falso negativo chega a ser maior que 57%

– Controle de ASCUS com captura híbrida: se HPV negativo: acompanhamento com CP; se HPV +: colposcopia

Slawson et al: Follow-up Pap smear for cervical atypia: Are we missing significant disease? J Fam Pract 36:289-293, 1993.

Wheelock e Kaminsky: Value of repeat cytology at time of colposcopy for the evaluation of CIN on Pap smears. J Reprod Med 43:815-817, 1989.

Wright et al: Comparison of management algorithms for the evaluation of women with low grade cytological abnormalities. Obstet Gynecol 85:202-210, 1995.

Mayeaux et al: A comparison of the reliability of repeat cervical smears and colposcopy in patients with abnormal cervical cytology. J Fam Pract 40:57-62, 1995

Jones et al: Evaluation of the atypical Pap smear. Am J Obstet Gynecol157:544-548, 1987.

– Diagnóstico citológico de ASCUS confere maior risco que um diagnóstico de LSIL: 8-15% das colposcopias detectarão HSIL

Slawson et al: Follow-up Pap smear for cervical atypia: Are we missing significant disease? J Fam Pract 36:289-293, 1993.

Cox et al – HPV testing by hybrid capture appears to be useful in triaging women with a cytologic diagnosis of ASCUS. Am J Obstet Gynecol 172:946-954, 1995

– Captura híbrida com 14 exploradores detecta 86% de CIN e 93% HSIL

Cox et al – HPV testing by hybrid capture appears to be useful in triaging women with a cytologic diagnosis of ASCUS. Am J Obstet Gynecol 172:946-954, 1995

– ASCUS na pós menopausa: mulheres mais velhas têm forte associação de HPV com CIN, sendo raro terem HPV sem CIN

– Se HPV+: é alto risco µ colpo; se HPV negativo: teste de Weed µ repetir CP

Symmans et al: Correlation of cervical cytology and HPV DNA detection in post-menopausal women. Int J Gynecol Pathol 11:204-209, 1992.

Schiffman et al: Response: HPV and cervical intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 85:1868-1870, 1993.

– Acompanhamento de LSIL – especialmente em mulheres mais velhas

– Acompanhar LSIL com CP acarreta risco inaceitável : em estudo do acompanhamento de LSIL com CP, 73% de 110 mulheres tiveram CP normal ou LSIL no acompanhamento, quando na verdade

tinham HSIL.

Mayeaux et al: A comparison of the reliability of repeat cervical smears and colposcopy in patients with abnormal cervical cytology. J Fam Pract 40:57-62, 1995

– Em mulheres mais velhas um diagnóstico citológico de SIL/NIC é menos preditivo que um teste para HPV positivo, pois lesões que simulam CIN são mais comuns com o aumento da idade:

CP LSIL:

– Abaixo dos 25 anos: em 80% há CIN na histologia;

– 25-35 anos: em 66% há CIN na histologia;

– 35-45 anos: em 51% há CIN na histologia;

– 45 anos: apenas 38% têm CIN na histologia.

Giles et al: Colposcopic assessment of the accuracy of cervical cytologic screening. Br Med J 296:11099-1102, 1988

CP LSIL:

– 16 a 28 anos: em 71% dos casos houve confirmação do diagnóstico por cinco experts em citologia;

– 29-39 anos: em 48% dos casos houve confirmação;

– 40 anos: apenas 35% dos casos forma confirmados pelos cinco experts.

Schiffman et al: Towards objective quality assurance in cervical cytopathology: Correlation of cytopathologic diagnoses with detection of high risk HPV types. Am J Clin Pathol 102:182-187, 1994

– A detecção de HPV em mulheres mais velhas é mais provavelmente devida a infecção por HPV persistente

Bjerre B: Invasive cervical cancer in a thoroughly screened population. J Exp Clin Res 9(Suppl):276, 1990.

– Prever recorrência da doença pós-tratamento:

– A persistência de HPV-DNA de alto risco é indicativa de progressão a NIC 3: estudo de pacientes que tiveram CP negativo mas presença de HPV alto risco persistentemente por mais de 36 meses demonstrou que todas progrediram a NIC 3; das pacientes com CP negativo e HPV negativo ou HPV baixo risco positivo, nenhuma progrediu a NIC 3

Remick et al: The presence of persistent high-risk genotipes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: Natural history up to 36 months. Int J Cancer 61:306-311, 1995.

– Pacientes que tornam-se negativas para o HPV (eliminam espontaneamente o vírus) têm baixo ou nenhum risco de desenvolver doença: estudo da resolução espontânea da alteração citológica provocada pelo HPV verificou que todas as pacientes HPV+, com CP+ que resolveram espontaneamente a alteração ao CP tornaram-se HPV negativas; algumas ficaram persistentemente positivas; 54% tornaram-se persistentemente HPV negativas – as que eliminaram a infecção e o fizeram precocemente estão sob baixo ou nenhum risco de desenvolverem doença (nenhuma que ficou HPV negativa desenvolveu doença); as que desenvolveram HSIL durante o acompanhamento foram geralmente as que persistiram HPV-DNA+ em elevados níveis quantitativos, em contraste com as intermitentemente positivas

– Considerando o potencial para falso negativo no CP, o retorno do teste HPV ao negativo proporcionará maior tranquilidade quanto à resolução do agente desencadeante do que o resultado citopatológico

Moscicki et al: Variability of HPV-DNA testing in a longitudinal cohort of young women. Obst Gynec 82:578-585, 1993.

– A positividade HPV persistente é previsora de risco para desenvolvimento subseqüente de HSIL

Meijer et al: Detection of HPV in cervical scrapes by PCR in relation to cytology: Possible implications for cancer screening. In Munoz N, Bosch FX, Shah KV (eds): The epidemiology of HPV and cervical cancer. Lyon, IARC Scientific Publications, 1992, 271-281.

– Após ablação ou excisão de lesão, aumenta a taxa de ASCUS e SIL – pesquisa de HPV-DNA útil para definir se a alteração do CP é reacional ao tratamento ou se é persistência (Cox 1996, dados não publicados: 20 de 24 casos pós crio foram HPV-DNAneg e apenas uma teve CIN comprovada em biópsia; 4 das 24 foram HPV-DNA+ e todas estas tiveram CIN comprovada).

  • Teste HPV negativo:

  1. a)Primeiro teste, paciente com lesão colposcópica e/ou citológica, histologia negativa: a lesão HPV negativa não diagnóstica geralmente não está relacionada ao HPV, porém é um simulacro, produzido como resultado de inflamação, reparo ou metaplasia escamosa;

    b)Trata-se de negativação de paciente anteriormente HPV positiva: pacientes que tornam-se negativas para o HPV (eliminam espontaneamente o vírus) têm baixo ou nenhum risco de desenvolver doença.

    Moscicki et al: Variability of HPV-DNA testing in a longitudinal cohort of young women. Obst Gynec 82:578-585, 1993.

  • Teste HPV positivo:

– Apenas 3% das mulheres HPV positivas desenvolvem câncer em 20-50 anos – a maior parte das mulheres HPV-positivas em qualquer ponto de suas vidas não está sob grandes riscos.

de Villiers M et al- HPV infections in women with and without abnormal cervical cytology. Lancet 2:703-705, 1987

Cox et al – HPV testing by hybrid capture appears to be useful in triaging women with a cytologic diagnosis of ASCUS. Am J Obstet Gynecol 172:946-954, 1995

Zur Hausen H – Intracellular surveillance of persisting viral infections: Homan genital cancer results from deficient cellular control of papillomavirus gene expression. Lancet 2:489-491, 1986

————— – Papillomaviruses in ano-genital cancer as a model to understand the role of viruses in human cancer. Cancer Res 49:4677-4681, 1989

a) Trata-se de uma adolescente ou mulher jovem: a maioria das mulheres jovens com um teste HPV positivo vai se tornar negativa em um período de 24 meses; das que se tornam persistentemente positivas para HPV-DNA de alto risco, 14,1% desenvolverão HSIL em dois anos.

Moscicki et al: The natural history of human papillomavirus infection as measured by repeated DNA testing in adolescent and young women. J Pediatr, 1998 Feb, 132:2, 277-84.

b) Trata-se de um vírus de baixo risco: pacientes com LSIL associada a tipos de HPV como 6 ou 11 estão sob risco zero ou baixo risco para desenvolver câncer; a maior parte das HSIL está associada a vírus de risco intermediário e alto

Ferenczy e Jenson: Efeitos teciduais e resposta do hospedeiro – a chave para a triagem racional da neoplasia cervical. In: Papilomavírus humano, Lorincz e Reid (eds) – Interlivros, Rio de Janeiro, 1997:171.

c) Trata-se de uma mulher com mais de 35 anos: a detecção de HPV em mulheres mais velhas é mais provavelmente devida a infecção por HPV persistente; há forte associação de HPV com CIN (nesta faixa etária, é raro haver HPV sem CIN)

Bjerre B: Invasive cervical cancer in a thoroughly screened population. J Exp Clin Res 9(Suppl):276, 1990.

Symmans et al: Correlation of cervical cytology and HPV DNA detection in post-menopausal women. Int J Gynecol Pathol 11:204-209, 1992.

d) Trata-se de vírus de alto risco: mulheres normais HPV-DNA+ 16/18 têm risco 11 vezes maior de detecção subseqüente

de CIN 2-3

Koutsky et al – Cohort study of risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 associated with cervical HPV infection. N Engl J Med 327:1272-1278, 1992

e) Trata-se de vírus de alto risco persistentemente positivo:

– A persistência de HPV-DNA de alto risco é indicativa de progressão a NIC 3: estudo de pacientes que tiveram CP negativo mas presença de HPV alto risco persistentemente por mais de 36 meses demonstrou que todas progrediram a NIC 3; das pacientes com CP negativo e HPV negativo ou HPV baixo risco positivo, nenhuma progrediu a NIC 3.