Paulo Marcelo Perin
Mariangela Maluf

Introdução

O desejo de ter filhos geralmente esta incluído nos planos de vida da maioria dos casais. Para aqueles que perseguem e não alcançam este objetivo, angústia, frustração e desespero são conseqüências comuns e têm um impacto negativo profundo na vida destes casais. A Organização Mundial da Saúde estima que a infertilidade afete cerca de 80 milhões de pessoas ao redor do mundo 29. Em geral, cerca de 10% a 15% dos casais apresentam infertilidade primária ou secundária, mas sua incidência varia de menos de 5% a mais de 30% entre os diferentes países. Embora a infertilidade possa ser causada por inúmeros fatores, com incidências variáveis em populações distintas, a produção anormal de gametas (oócitos e/ou espermatozóides), os defeitos tubáricos ou a endometriose pélvica representam as suas causas mais freqüentes.

A infecção genital é a principal causa de infertilidade conjugal, quer em países desenvolvidos como em desenvolvimento, afetando não somente as trompas de Falópio, mas também todo o sistema urogenital, tanto feminino como masculino. O papel etiológico dos agentes infecciosos bacterianos na gênese da infertilidade é bem estabelecido. Na mulher, a infecção do trato genital superior pode causar um processo aderencial pélvico e/ou obstrução tubárica, os quais podem interferir na captação oocitária após a ovulação, no transporte dos gametas e/ou embrião e, no próprio processo de fertilização. No homem, o processo infeccioso bacteriano pode causar uma lesão testicular, com interferência direta na espermatogênese ou mesmo levar a um resposta imune com produção de anticorpos anti-espermatozóide, e/ou uma lesão obstrutiva do seu trato urogenital. Por outro lado, o papel dos agentes infecciosos virais sobre a fertilidade humana ainda é obscuro.

A infecção do trato genital pelo papilomavírus humano (HPV) representa uma das doenças sexualmente transmissíveis mais comuns na atualidade, afetando cerca de 20% a 40% da população feminina sexualmente ativa. O HPV, um vírus de DNA de dupla hélice, induz o aparecimento de lesões epiteliais benignas da genitália externa e interna e está intimamente associado a certas doenças ano-genitais malignas, em especial o câncer do colo uterino. Por outro lado, a influência do HPV sobre a fertilidade humana ainda não foi bem estabelecida, embora estudos relatando uma associação entre infertilidade e a presença do HPV em células espermáticas 59,83 ou no trato genital feminino 93 tenham sido publicados recentemente.

Neste capítulo serão descritos os aspectos epidemiológicos do HPV na população infértil, seus possíveis efeitos sobre o mecanismo reprodutivo, bem como os riscos potenciais das novas técnicas de reprodução assistida na introdução de material genético exógeno na linhagem celular germinativa humana.

Características e Infectividade do Papilomavírus Humano

O HPV é um vírus de DNA de dupla hélice pertencente à família Papovaviridae, relativamente pequeno (cápside, 55-nm; genoma de 8.000 pares de bases; peso molecular de 5×106 daltons), que possui uma estrutura icosaédrica e o seu genoma é organizado em três regiões principais: a) uma região reguladora não codificadora, localizada ao lado da região codificadora inicial, que contém seqüências que controlam a transcrição através da RNA polimerase; b) uma região contendo vários dos genes envolvidos na replicação viral que são expressos imediatamente após a infecção da célula hospedeira pelo vírus, denominada região codificadora inicial e; c) uma região que contém os genes que serão expressos tardiamente após a infecção viral, denominada região codificadora tardia. Esta última compreende duas partes: L1, a região maior que forma a cápside viral e; L2, que empacota o DNA viral com os outros produtos dos genes 25 (Fig. 16.1).

A expressão dos genes da região inicial controla a replicação, transcrição e transformação celular do DNA viral e, adicionalmente, tem um papel na proliferação celular não controlada. Os produtos codificados pelos genes E1 e E2 são críticos para a replicação viral. Por outro lado, os genes E6 e E7, além destes produtos codificam também onco-proteínas que têm um papel fundamental na imortalização e transformação da célula hospedeira.

O HPV é um parasita intracelular obrigatório encontrado no citoplasma celular (epissômico) e, para reproduzir-se, deve se deslocar para o interior do núcleo. Quando o DNA viral é incorporado ao material nuclear da célula hospedeira ele é denominado integrado. Somente a forma integrada do HPV é capaz de causar a transformação maligna, pois o DNA do HPV assume o controle do material genético da célula hospedeira, garantindo a expressão persistente das onco-proteínas E6 e E7, as quais podem ligar-se e, presumivelmente, inativar as proteínas celulares codificadas pelos genes supressores tumorais p53 e retinoblastoma (Rb) do hospedeiro, respectivamente, rompendo deste modo o controle do ciclo celular e promovendo a proliferação descontrolada das células do hospedeiro que foram permanentemente modificadas. A instabilidade genética resultante pode permitir, através de co-fatores adicionais ou de mutações ao acaso, um aumento da lesão celular e cromossômica causados pelo HPV. A infecção não integrada é denominada de infecção produtiva, pois partículas virais intactas são formadas. Por outro lado, quando o DNA do HPV é integrado ao DNA da célula hospedeira não há produção de partículas virais e a infecção é denominada não produtiva. Paradoxalmente, a infecção produtiva resulta no aparecimento de lesões verrucosas com baixa probabilidade de desenvolvimento de câncer e, a infecção não produtiva que geralmente não determina manifestações clínicas evidentes a olho nu, apresenta um potencial elevado de malignização. O papilomavírus humano é um vírus espécie-específico com tropismo por tecidos epiteliais, que usualmente infecta apenas a pele e as membranas mucosas. É categorizado e subdividido de acordo com o genótipo do DNA com base nos alinhamentos das seqüências de nucleotídeos das estruturas de leitura aberta (ORF) das regiões L1, E6 e E7 32. Mais de cem tipos de HPV foram identificados e cerca de 40 podem infectar o epitélio do trato genital feminino e masculino 30. Os tipos comuns do HPV genital podem ser divididos em três categorias de acordo com o seu potencial onocogênico: a) tipos de risco elevado; b) tipos de risco intermediário e; c) tipos de risco baixo (Tabela 16.1).

O grupo de potencial oncogênico baixo inclui os tipos 6, 11, 40, 42, 43, 54, 61, 70, 72, 81 e CP6108. Eles estão associados a verrugas genitais, condiloma acuminado e, em alguns casos a lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), porém raramente aos cânceres invasivos. O grupo de potencial oncogênico elevado inclui os HPVs do tipo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82. Estes tipos de risco elevado são comumente detectados em mulheres com lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL) e cânceres invasivos. Os tipos oncogênicos 16, 18, 45 e 56 do HPV são os mais comuns no grupo de risco elevado. Os tipos 26, 53 e 66 fazem parte do grupo de risco intermediário. Embora estes tipos estejam associados a HSIL, eles são raramente detectados em carcinomas invasivos 70.

Para a sua transmissão, o HPV requer um contato direto com o tecido epitelial. A exposição ao vírus durante o contato sexual (genital-genital, oro-genital, ano-genital) representa a via de infecção mais comum e as lesões ocorrem nas áreas urogenital e ano-retal 9. A transmissão vertical durante a gestação, no parto ou no puerpério também foi documentada, embora não se saiba a sua prevalência ou o seu grau de infectividade 16,99. A transmissão não sexual, através de objetos inanimados (luvas, instrumentos cirúrgicos, roupa íntima) também foi descrita, mas a sua ocorrência é rara 65. A perda da integridade da pele ou da mucosa do trato genital permite a entrada do vírus. Este penetra nas células através da camada basal, mas sua proliferação ocorre no epitélio parcialmente diferenciado (camadas para-basal, espinhosa e granular). A replicação do DNA, síntese protéica e montagem das partículas virais ocorrem na camada celular granular. Existem evidências de que o vírus pode ser encontrado em células estromais sub-epiteliais, que funcionariam como seu reservatório. Lesões do revestimento epitelial parecem facilitar a sua transmissão e explicam a maior prevalência do HPV na cérvix e na região superior da vagina. A zona de transformação cervical, constituída por orifícios glandulares e criptas, favorece a entrada das partículas virais do HPV e, provavelmente, por este motivo esta região é freqüentemente envolvida na infecção pelo HPV. A manifestação clínica da infecção pelo HPV resulta de uma interação complexa envolvendo o tipo viral, o sistema imune do paciente e certas características do seu comportamento (atividade sexual, nutrição, tabagismo, consumo de álcool, uso de hormônios esteróides). Conseqüentemente, a presença isolada do HPV em um determinado paciente parece ser insuficiente para causar a neoplasia cervical, uma vez que a expressão e a manifestação clínica do HPV sofrem um impacto profundo a partir da mudança de um dos fatores de risco ou da presença de co-fatores necessários para a transformação dos queratinócitos.

Características Epidemiológicas

População Geral

Devido ao caráter transitório da infecção pelo HPV, torna-se impossível definir com exatidão sua incidência ou prevalência. A maioria das infecções genitais causadas pelo HPV é sub-clínica e sua identificação é feita apenas através de citologia, de colposcopia, de biópsia ou de técnicas de detecção do DNA viral (amplificado ou não), o que torna as estimativas de sua incidência ou prevalência, baseadas em lesões genitais aparentes, sub-estimadas. A prevalência da infecção pelo HPV em mulheres assintomáticas em idade reprodutiva varia de 5% a 40% 57 e em mulheres jovens sexualmente ativas de 27% a 43% 14,52. Recentemente, um exame sorológico baseado em alvos antigênicos específicos para os diferentes tipos de HPV foi desenvolvido. Estudos de soro-prevalência usando esta tecnologia demonstraram que em mulheres sem evidência clínica de infecção pelo HPV, cerca de 3% a 43% têm anticorpos para o HPV-16 e cerca de 9% a 25% têm anticorpos para o HPV-6 ou HPV-11 48,72,102.

Dados de estudos populacionais sugerem que a incidência de infecções genitais pelo HPV, incluindo aquelas por tipos de baixo potencial oncogênico, diminui com a idade a partir dos 25 anos 39,52, embora um segundo pico de incidência ocorra por volta dos 55 anos 88. A idade, portanto, representa um fator importante na determinação da persistência da infecção pelo HPV. A detecção do HPV em mulheres jovens traduz-se com freqüência como uma infecção adquirida recentemente e de provável caráter transitório. Por outro lado, a detecção desta infecção em mulheres mais velhas, principalmente aquela causada por tipos virais de elevado potencial oncogênico, reflete a propensão deste grupo etário a uma infecção persistente 39,52. As manifestações clínicas da infecção pelo HPV incluem infecção assintomática e alterações celulares displásicas que variam de alterações histológicas menores (coilocitose) a alterações celulares pré-cancerosas e malignas. Estudos avaliando a infecção cervical pelo HPV sugerem que esta é muitas vezes um fenômeno transitório ou intermitente e, apenas um pequeno grupo de mulheres apresentará o mesmo tipo do HPV em amostras subseqüentes. A maioria das mulheres fica livre do vírus dentro de 9 a 12 meses a partir da sua detecção 37,39,52. Moscicki et al. 68 realizaram citologia, colposcopia e pesquisa do vírus a cada quatro meses em 618 mulheres jovens positivas para o HPV e verificaram que cerca de 70% destas pacientes tiveram resolução espontânea da infecção dentro de um período de 24 meses. Em seu estudo, Franco et al. 40 observaram que das 177 pacientes com resultado positivo para o HPV no início do estudo, apenas 35% permaneceram infectadas após 12 meses. Adicionalmente, verificaram que a taxa mensal de eliminação do vírus foi de 12% para os tipos não oncogênicos e de 9,5% para os tipos oncogênicos. A aquisição de um tipo oncogênico do vírus aumenta a probabilidade de persistência da infecção pelo HPV o que determinaria a integração viral ao DNA do hospedeiro, talvez por uma falha em seu mecanismo de defesa e/ou pela presença de co-fatores específicos, causando o aparecimento de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL), com um risco de cerca de 10% a 20% de progressão para o câncer invasivo 47.

Embora a prevalência do HPV nos homens seja similar àquela observada em mulheres, a história natural desta infecção viral no homem é menos compreendida. Este fato está relacionado a dois fatores importantes: 1) Muitas vezes as infecções pelo HPV são inaparentes no homem e não têm conseqüências mais sérias como na mulher e; 2) Ao contrário da facilidade de obtenção de grande quantidade de células da mucosa epitelial através de esfregaços cervicais para a detecção do DNA do HPV nas mulheres, poucas células esfoliadas são obtidas em esfregaços da glande ou da uretra peniana, tornando difícil a detecção do DNA do HPV no homem. Contudo, apesar destas dificuldades, estudos clínicos e virológicos definiram o espectro da infecção pelo HPV no trato genital masculino, demonstrando grau variado de concordância entre a infecção dos dois parceiros no casal 4,5,8,18,84. Por outro lado, demonstrou-se uma forte correlação entre a infecção genital pelo HPV no homem e a presença de lesões intra-epiteliais escamosas em sua parceira regular 5,89. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel que homens saudáveis têm como transmissores potenciais da infecção pelo HPV. O DNA do HPV foi identificado em amostras urinárias 54, em diferentes estruturas do trato urogenital masculino, tais como uretra, próstata, vesícula seminal e bexiga 74,82,86,104, e no líquido seminal e em espermatozóides de homens com infecções sub-clínica e clínica 20,59. Adicionalmente, verificou-se que o HPV parece ser capaz de ser transcrito em células espermáticas infectadas, enfatizando o possível papel destas células como vetores na transmissão do vírus 60.

População Infértil

A prevalência da infecção pelo HPV na população infértil assintomática foi avaliada nas diferentes etapas da investigação e do tratamento da infertilidade variando de 5% a 15% na população feminina 63,93,95,96 e de 4% a 33% (pesquisa na fração seminal) ou de 25% a 46% (pesquisa na fração espermática) na população masculina 59,73,74,96. Os diferentes estudos realizados não demonstraram diferença da prevalência da infecção pelo HPV na população infértil feminina quando comparada à população geral de controle, mesmo sendo este um grupo específico de mulheres com padrão sexual e antecedente de uso de anticoncepcionais orais distintos da população geral. Lundqvist et al. 63, realizaram o rastreamento citológico e pesquisa do HPV através da técnica de reação de cadeia da polimerase (PCR) em esfregaços cervicais obtidos de 214 mulheres inférteis e compararam os resultados àqueles obtidos de 197 mulheres saudáveis (grupo controle). Os autores observaram que o HPV do tipo 16 foi o mais prevalente nos dois grupos estudados e que as taxas de citologia anormal e de resultado positivo para o HPV na população infértil (2,3% e 7,0%, respectivamente) e no grupo controle (4,1% e 9,1%, respectivamente) foram similares. Em seu estudo, Strehler et al. 95, observaram uma prevalência de 7,8% (23/294) de certos tipos oncogênicos do HPV (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58) em esfregaços cervicais da população infértil submetida à indução da ovulação com gonadotrofinas e de 8,4% (192/2262) na população controle não verificando diferença entre os grupos.

Na população masculina, a pesquisa do DNA do HPV em amostras seminais revela resultados distintos quando homens sintomáticos e assintomáticos, com ou sem parceiras infectadas, são comparados. Em seu estudo, Lai et al. 59 avaliaram as frações seminal e espermática de amostras de sêmen, obtidas de 24 pacientes aleatoriamente selecionados em uma clínica de tratamento de infertilidade, para a presença de DNA e de seqüências de RNA do HPV dos tipos 16 e 18 através da técnica de PCR. O HPV tipo 16 foi encontrado em duas das 24 (8,3%) amostras de líquido seminal. Contudo, nenhuma delas mostrou evidência de transcrição do HPV. Por outro lado, este tipo de HPV foi encontrado em 25% (6/24) das amostras da fração espermática e, identificou-se a presença de sinais de transcrição viral em duas amostras contendo células espermáticas positivas para o DNA do HPV do tipo 16. A prevalência do DNA e do RNA do HPV do tipo 18 nas frações seminal e espermática foi maior do que aquela observada para o HPV do tipo 16. O DNA do HPV do tipo 18 foi encontrado em oito das 24 (33,3%) amostras de líquido seminal e duas destas amostras positivas continham um sinal fraco de RNA viral específico. Onze das 24 (45,8%) amostras espermáticas foram positivas para o DNA do HPV do tipo 18 e destas, cinco mostraram sinais de transcrição viral específica. Os autores ressaltaram que a demonstração da presença de um segmento da seqüência de DNA do HPV quer no plasma seminal ou nas células espermáticas, não prova necessariamente a presença do vírus infectante ou mesmo do genoma viral completo. A identificação da infecção das células espermáticas pelo HPV tem um significado clínico importante, pois implica na possibilidade destas atuarem como vetores ou carreadores do vírus no ato sexual, tendo um papel importante na fisiopatologia da infecção pelo HPV.

Pakendorf et al. 74 realizaram peniscopia em 96 homens inférteis sexualmente ativos para a determinação da prevalência da infecção sub-clínica pelo HPV. Dos 96 pacientes, vinte apresentaram lesões penianas aceto-brancas à peniscopia. Treze pacientes (13.5%), 12 confirmados com biópsia das lesões aceto-brancas e um através da hibridização in situ das células epiteliais da uretra distal, tiveram um resultado positivo para o HPV. Os autores concluíram que o HPV tem uma prevalência elevada entre homens assintomáticos que procuram tratamento da infertilidade e que a peniscopia deveria ser incluída como exame de rotina na investigação do fator masculino de infertilidade. Tanaka et al. 96 avaliaram a prevalência da infecção pelo HPV do tipo 16 em 192 pacientes submetidas à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE), pesquisando a presença do DNA deste HPV em esfregaços cervicais das pacientes e em amostras seminais de seus parceiros através da técnica de PCR. Na população estudada, os autores observaram dez mulheres (5,5%) e quatro homens (4,0%) com resultado positivo para o HPV pesquisado. Destes, apenas uma parceira apresentou resultado positivo no colo uterino, mostrando uma discordância das prevalências feminina e masculina nos casais avaliados. Recentemente, Olatunbosun et al. 73 avaliaram amostras seminais de 85 voluntários para a detecção de seqüências de DNA do HPV através da técnica de PCR. Deste grupo, quarenta e cinco homens tinham antecedentes ou evidência clínica de infecção atual por HPV (grupo de estudo) e 40 eram doadores de sêmen saudáveis. O DNA do HPV foi detectado em células espermáticas de 24 dos 45 pacientes (53%) com antecedentes de infecção prévia ou atual pelo HPV em contraste com três de 40 (8%) homens saudáveis (p<0.001).

Adicionalmente, o DNA viral foi detectado em 21 de 32 pacientes (66%) com lesões evidentes e em seis de 53 (11%) pacientes sem tais lesões (p<0.001). Os autores concluíram que mesmo em uma população de homens aparentemente saudáveis a incidência de infecção pelo HPV, demonstrada em amostras seminais através da técnica de PCR, variou de 8% a 11%, ressaltando a importância da pesquisa de DNA do HPV nas amostras de possíveis candidatos à doação espermatozóides, devido ao risco potencial de transmissão da doença. Em seu estudo, Aynaud et al. 3, avaliaram a freqüência do HPV em amostras seminais de 111 homens cujas parceiras apresentavam confirmação histológica de infecção genital pelo HPV. A análise seminal pela técnica de PCR revelou a presença de DNA do HPV em 23,4% das amostras avaliadas, com incidências diferentes nesta população, de acordo com a presença ou ausência e a localização das lesões. Do grupo de pacientes com amostras seminais positivas para o HPV, 48% do pacientes apresentavam lesão uretral, 22% lesão peniana e apenas 2% não tinham lesões associadas. Neste grupo, o mesmo tipo de HPV foi detectado tanto nas amostras seminais como nas lesões peniana ou uretral. Contudo, os autores não confirmaram uma prevalência elevada de HPV no sêmen de homens sem lesões detectáveis e sugeriram que o mecanismo da contaminação seminal pelo HPV estaria associado à esfoliação das células infectadas presentes na lesão uretral durante a ejaculação e, provavelmente, à abrasão da lesão peniana durante a relação sexual.

Papilomavírus Humano e Infertilidade

A infecção viral do trato reprodutivo pode determinar a perda da integridade anatômica e fisiológica dos órgãos, causar doenças sistêmicas e distúrbios endócrinos importantes. As propriedades imunossupressoras do plasma seminal, que são importantes para prevenir uma reação do trato reprodutivo feminino aos antígenos espermáticos, podem ter um papel crítico nas doenças sexualmente transmissíveis, não apenas pelo fato dos espermatozóides atuarem como potenciais vetores da propagação viral, mas também porque a resposta imune do trato genital feminino aos agentes infecciosos presentes neste fluído biológico é certamente afetada pelos níveis elevados de fatores imunossupressores presentes no plasma seminal 56. No homem, a infecção viral das células germinativas pode resultar em alterações da função testicular, o que representa um sério risco para a fertilidade e a saúde do indivíduo, e na possível transmissão de mutações induzidas pelo vírus às gerações subseqüentes.

A infecção genital pelo papilomavírus humano é hoje a doença viral sexualmente transmissível mais comum e representa um problema importante de saúde pública na população mundial devido à sua associação evidente ao câncer de colo uterino na população feminina e potencial a outras doenças malignas ano-genitais. Por outro lado, a correlação entre a identificação da infecção viral no trato reprodutivo feminino ou masculino e seu possível efeito sobre a saúde reprodutiva do casal ainda permanece obscura e gera preocupações importantes relacionadas à disseminação da doença, associação à infertilidade e, principalmente, ao desenvolvimento de anomalias embrionárias e fetais (Tabela 16.2).

Efeitos dos Hormônios Esteróides na Infecção Pelo HPV

O HPV, através de seus tipos de risco elevado, é tido como o agente responsável pela gênese do câncer cervical. Isoladamente, contudo, a presença e a expressão do vírus no trato genital não seriam suficientes para a indução da carcinogênese e, provavelmente, a associação a outros fatores, tais como, os hormônios esteróides, seria necessária para o estabelecimento e/ou progressão da doença 1. No câncer cervical induzido pelo HPV, o seu DNA esta geralmente integrado ao genoma do hospedeiro o que determina, com freqüência, a perda da proteína E2. Uma vez que as proteínas E2 e E7 do HPV do tipo 16 são necessárias para a replicação e modulação da expressão gênica viral e transformação celular, respectivamente, a integração viral resultaria na expressão desregulada das proteínas E6 e E7. Vários estudos demonstraram que as proteínas E2 e E7 poderiam gerar um sinal intracelular pró-apoptótico em linhagens celulares transformadas ou não pelo HPV 87,100,101. O estrógeno e a progesterona amplificam os níveis de morte celular induzida pela proteína E2 101. Por outro lado, a expressão exagerada da proteína E6 do HPV do tipo 16 pode bloquear a apoptose induzida pelas proteínas E2 e E7 100. Deste modo, durante a infecção viral, os sinais pró-apoptóticos gerados por estas proteínas são contra-balançados pela proteína E6. Os eventos de integração aleatória que quebram o gene E2 do HPV do tipo 16 perturbariam o equilíbrio entre os sinais pró e anti-apoptóticos, resultando em células que são mais propensas à proliferação e, portanto, à produção do câncer cervical 87. Na perda desta proteína, o estrógeno e a progesterona representariam um fator de risco na carcinogênese cervical tanto através de seus efeitos sobre o HPV ou sobre a expressão gênica celular.

A expressão gênica do HPV dos tipos 16 e 18 é induzida diretamente por hormônios esteróides através de elementos de resposta hormonal presentes na região reguladora do genoma viral em células humanas HeLa e em queratinócitos cervicais. Paralelamente, um aumento da transcrição do HPV dos tipos 16 e 18 é notado in vitro e in vivo na presença de estrógeno 23,43,64,67 ou progesterona 23,64,103. A maioria dos casos de câncer cervical ocorre na região do colo uterino mais sensível ao estrógeno, conhecida como zona de transformação, região pela qual o HPV apresenta tropismo na infecção e na persistência da doença 2,35. A prevalência do HPV do tipo 16 é maior em esfregaços obtidos de mulheres grávidas do que naqueles obtidos de mulheres não grávidas, fato que poderia ser explicado pelo aumento da replicação viral resultante dos elevados níveis de estrógeno e progesterona presentes na gestação 38. O uso prolongado de anticoncepcionais orais está correlacionado ao aumento a taxa de detecção do vírus em usuárias 51, ao aumento do risco relativo de manifestação do condiloma acuminado 85 e seria um fator de risco para a lesão intra-epitelial de alto grau e para o câncer cervical 71,81,106.

Baseando-se nas observações acima expostas, Strehler et al. 95 utilizaram os tratamentos envolvendo técnicas de reprodução assistida como um modelo in vivo para uma análise mais detalhada da interação entre os hormônios esteróides e o HPV. Neste estudo, os autores avaliaram a presença dos tipos de risco elevado do HPV em esfregaços cervicais, obtidos antes e depois da estimulação ovariana com gonadotrofinas, em 294 pacientes submetidas à inseminação intra-uterina (80 casos) e à FIVETE (214 casos). A resposta ovariana foi monitorizada com determinações dos níveis séricos de estradiol. Adicionalmente, comparou-se a prevalência dos tipos de risco elevado do HPV nesta população com aquela de um grupo de mulheres que não foram submetidas à estimulação ovariana e, a carga viral destes tipos de HPV foi determinada na população de pacientes positivas para o vírus, com o objetivo de identificar um possível efeito da estimulação ovariana neste grupo.

Neste estudo, os autores não foram capazes de demonstrar uma associação positiva entre a estimulação ovariana com gonadotrofinas e o aumento da detecção ou da carga viral dos tipos de risco elevado do HPV. Este fato poderia resultar da curta duração da estimulação ovariana (cerca de 10,6 dias em média) e, conseqüente, menor período de exposição das pacientes aos níveis elevados de estradiol, o que seria insuficiente para determinar um efeito biológico no HPV, embora tenha sido demonstrado in vitro que o tratamento com estrógeno de células SiHa, uma linhagem celular de carcinoma cervical humano, pode induzir a replicação viral, com um aumento de duas vezes na transcrição do RNA do HPV do tipo 16 após 4 horas e de oito vezes após 16 horas 66. Deste modo, o efeito da estimulação ovariana com gonadotrofinas sobre a prevalência dos tipos de risco elevado do HPV e uma possível influência no risco de câncer cervical não foram demonstrados na população deste estudo. Contudo, não se pode excluir a possibilidade de que uma estimulação ovariana por um período de tempo maior possa influenciar a prevalência do HPV. Níveis séricos de estradiol cronicamente elevados, presentes em pacientes submetidas a múltiplos ciclos de estimulação ovariana poderiam estar associados a um aumento da expressão gênica do HPV.

Efeitos do HPV Sobre os Gametas Masculinos

O mecanismo de introdução do DNA exógeno nas células espermáticas, tanto por infecção natural como experimental, bem como os seus efeitos subseqüentes na fisiologia dos espermatozóides ainda são controversos. A detecção de DNA ou RNA genômico viral nos espermatozóides foi relatada em casos de infecção pelo vírus da hepatite C 10, da síndrome da imunodeficiência adquirida 34 e do papilomavírus humano 20,59,60. Entretanto, o método de propagação destes vírus nas células espermáticas, suas conseqüências fisiopatológicas e o significado clínico de sua presença no plasma seminal são obscuros. Seqüências genômicas de DNA de vários tipos do HPV podem ser encontradas em uma proporção substancial de células espermáticas de pacientes em tratamento de infertilidade e esta observação tem um significado biológico e clínico específicos, pois a expressão de certos genes virais, incluindo os oncogenes E6 e E7, tem sido notada nestas células. Contudo, a demonstração da presença de parte da seqüência do DNA do HPV nas células espermáticas por si só não prova necessariamente a presença do genoma viral completo ou de vírus infectantes e ainda não existem evidências sugerindo a multiplicação do HPV nestas células. Em seu estudo, Pao et al. 77 confirmaram que a grande maioria, se não a totalidade dos espermatozóides, não contem o genoma viral completo do HPV. Por outro lado, os autores observaram que a porção oncogênica do DNA do HPV esta presente nos espermatozóides e que as regiões E6 e E7 do genoma viral foram preferencialmente absorvidas e/ou retidas pelas células espermáticas.

Sugere-se que a absorção do DNA exógeno do HPV pelo espermatozóide ocorra através do contato direto deste com as células infectadas do trato reprodutivo. Duas regiões, a equatorial e a pós-acrossomal, da cabeça do espermatozóide representam os sítios preferenciais de absorção dos fragmentos de DNA do HPV (Fig. 16.2).

Embora existam algumas evidências de internalização destes fragmentos na cabeça do espermatozóide, estes se localizam na superfície externa da membrana espermática na maioria das vezes 41 e uma classe de proteínas de 30-35 kDa, relacionada aos genes classe II do complexo de histocompatibilidade foi implicada como proteína ligadora do DNA exógeno na superfície dos espermatozóides, indicando que a interação deste DNA com as células espermáticas não é um evento casual mas sim dependente de um mecanismo molecular baseado na interação de fatores protéicos específicos 61,105. Por outro lado, o status das células espermáticas em termos de capacitação ou reação acrossomal é irrelevante para este mecanismo de ligação dos fragmentos de DNA exógeno, uma vez que este ocorre na região pós-acrossomal da cabeça do espermatozóide.

A presença do DNA genômico do HPV nos espermatozóides tem efeitos distintos sobre os diferentes parâmetros da função espermática e os estudos apresentam resultados conflitantes (Tabela 16.3).

Lai et al. 60, avaliaram os possíveis efeitos do HPV na qualidade seminal e nos diferentes parâmetros da motilidade espermática através da análise seminal computadorizada. Os autores verificaram que a incidência de astenozoospermia em pacientes positivos para o DNA do HPV dos tipos 16 e/ou 18 foi significativamente maior do que aquela observada em pacientes negativos para o vírus (75% versus 8%, respectivamente; p=0.008). Não se observou diferença entre os grupos quando a concentração espermática foi comparada. A análise dos parâmetros de motilidade revelou uma redução significativa da velocidade curvilinear (p=0.03), velocidade linear (p=0.04) e da amplitude média do deslocamento lateral da cabeça dos espermatozóides (p=0.04) nos pacientes com amostras infectadas pelo HPV. Não houve diferença entre os grupos quando os parâmetros de progressão linear e a freqüência de batimento de cauda dos espermatozóides foram comparados. Posteriormente, Connelly et al. 28 confirmaram estes achados avaliando os efeitos da exposição dos espermatozóides aos fragmentos de DNA das regiões E6 e E7 do HPV dos tipos 16, 18, 31, 33, 6 e 11. Estes autores observaram que embora a motilidade dos espermatozóides tenha aumentado após a exposição aos fragmentos de DNA do HPV, os parâmetros de amplitude média do deslocamento lateral da cabeça e de velocidade curvilinear dos espermatozóides foram significativamente menores para os tipos 16, 6 e 11 do HPV. Considerando-se que a redução da velocidade e da amplitude do deslocamento lateral da cabeça dos espermatozóides têm sido ligadas a uma redução de sua capacidade de fertilização 31,79, os autores sugerem uma provável associação entre a presença do HPV, que causa uma redução da função espermática, e a infertilidade masculina. Resultados similares com relação ao aumento da motilidade dos espermatozóides foram observados em um estudo no qual as células espermáticas foram transfectadas com fragmentos da região L1 do DNA do HPV 11. Em oposição aos estudos anteriores, a velocidade curvilinear e a porcentagem de hiper-ativação dos espermatozóides, parâmetros associados diretamente à capacidade de fertilização dos espermatozóides, foram significativamente maiores no grupo transfectado quando comparado ao grupo controle neste estudo. Os autores ressaltam, no entanto, que a sua observação baseou-se em uma situação na qual a transfecção intencional dos espermatozóides foi realizada com moléculas expostas do DNA do HPV e não na infecção natural dos pacientes pelo HPV o que poderia explicar esta diferença de resultados. Adicionalmente às alterações dos parâmetros de motilidade dos espermatozóides, a exposição ao DNA do HPV pode causar fragmentação apoptótica do DNA espermático. Em um estudo no qual os espermatozóides foram expostos aos fragmentos de DNA da região E6-E7 do HPV dos tipos 16, 18, 31, 33, 6 e 11 por 24 horas, verificou-se que o DNA espermático sofreu fragmentação significativa, característica de apoptose e não de necrose, após a exposição ao DNA do HPV dos tipos 16 e 31 28. Por outro lado, os tipos 18, 33, 6 e 11 não comprometeram a integridade do DNA espermático. Baseando-se nestes dados, os autores sugeriram que os tipos 16 e 31 do HPV poderiam determinar um desenvolvimento embrionário inadequado através da apoptose espermática, ocasionado a falha da implantação embrionária ou mesmo a perda da gestação estabelecida. Corroborando esta hipótese, um estudo clínico comparando a incidência de DNA do HPV em produtos de abortamento espontâneo e eletivo no primeiro trimestre da gestação, observou que 15 de 25 (60%) amostras de produtos de abortamento espontâneo e três de 15 (20%) amostras de produtos de abortamento eletivo foram positivas para as regiões E6 e E7 do DNA do HPV e que no grupo de abortamento espontâneo, o tipo 16 do HPV foi o mais identificado (29%) nas células do sinciciotrofoblasto 49. Recentemente, Lee et al. 62 procuraram determinar quais as regiões gênicas do espermatozóide que eram alvo ao HPV. Para tanto, os autores submeteram espermatozóides lavados à exposição a fragmentos de DNA do HPV dos tipos 6b, 11, 16, 18, 31 e 33 por um período de 24 horas e avaliaram a integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 dos espermatozóides. Paralelamente, avaliaram os efeitos destes fragmentos sobre a motilidade e hiper-ativação espermática. Neste estudo, foi observado que certos tipos de HPV degradaram seletivamente diferentes exons de genes importantes dos espermatozóides (HPV 16, exon 8; HPV 18, exon 5) ao passo que outros tipos (HPV 31, 33) não apresentaram nenhum efeito sobre os exons do gene p53. A motilidade espermática, mas não a hiper-ativação foi reduzida para todos os tipos de HPV, sugerindo que a retenção parcial da capacidade de fertilização dos espermatozóides através manutenção da hiper-ativação possibilitaria a transmissão de genes danificados dos espermatozóides no processo de fertilização.

A presença de partículas virais ou de fragmentos de DNA do HPV foi demonstrada tanto na fração líquida como na fração celular do sêmen através da técnica de PCR. No espermatozóide, o processo de absorção do DNA exógeno é rápido, requerendo apenas 15 minutos 41. Por outro lado, não se sabe ao certo se este processo de absorção é reversível ou se o DNA exógeno pode ser removido através das técnicas atualmente utilizadas para o beneficiamento seminal nos procedimentos de medicina reprodutiva, fatos importantes no contexto da atuação do espermatozóide como um vetor para a transmissão do HPV. As diferentes técnicas de processamento seminal, nas quais o líquido seminal e outros elementos celulares são separados dos espermatozóides, mostraram-se efetivas para a redução da carga viral a níveis indetectáveis através de técnicas sensíveis de PCR-DNA e PCR-RNA em pacientes portadores do HIV 12,46. Por outro lado, Brossfield et al. 11 avaliaram a eficácia de três técnicas distintas de processamento seminal (lavagem por centrifugação, lavagem em gradiente descontínuo de colóide ou em test-yolk buffer – TYB) para a remoção do DNA exógeno de espermatozóides infectados com fragmentos da região L1 do DNA do HPV. Os resultados do estudo demonstraram que as três técnicas de processamento seminal foram incapazes de remover o DNA do HPV dos espermatozóides. A tenacidade de ligação do DNA viral aos espermatozóides, provavelmente decorrente da internalização de parte deste DNA no espermatozóide, representa um fato preocupante uma vez que, no processo de fertilização in vivo ou in vitro, toda a cabeça do espermatozóide e, conseqüentemente, o DNA exógeno aderido a esta região, são transferidos para o interior do oócito através de um processo que se assemelha à endocitose. Em um estudo posterior, Olatunbosun et al. 73 verificaram que o processamento seminal através de sua lavagem e separação por migração (técnica de swim-up) foi incapaz de reduzir o DNA viral abaixo dos níveis passíveis de detecção pela técnica de PCR, não eliminando desta forma, o risco de transmissão do HPV.

Efeitos do HPV sobre os Gametas Femininos e Embriões

As células do trato reprodutivo feminino, os oócitos, embriões e blastocistos estão incluídos no grupo de alvos potenciais dos espermatozóides carreadores de fragmentos de DNA exógeno (Fig. 16.3).

Embora alguns fragmentos de DNA possam estar integrados no interior da cabeça do espermatozóide, a grande maioria localiza-se na superfície externa de sua membrana, o que torna possível a transfecção do DNA aderido à sua superfície externa para a membrana plasmática do oócito ou das células embrionárias no momento do contato. Este fato representa um problema potencial importante, quer in vivo (trato reprodutivo feminino) como in vitro (através de técnicas de reprodução assistida), pois a transferência inadvertida do DNA exógeno oriundo de vírus, bactérias ou outras fontes genômicas, a partir do espermatozóide ou do sistema de cultivo celular pode ocorrer. As conseqüências desta transmissão indesejada estariam associadas à apoptose celular embrionária, determinando um desenvolvimento embrionário anômalo, que resultaria na falha de implantação, abortamento espontâneo inicial ou mesmo infecção fetal (Tabela 16.4).

A capacidade de absorção do DNA exógeno do HPV pelo oócito bem como o papel de sua zona pelúcida como barreira à entrada deste DNA em seu interior foram avaliados em um estudo experimental, no qual oócitos de hamster intactos ou não (removidos de sua zona pelúcida) e oócitos fixados em formalina foram expostos a fragmentos da região L1 do DNA do HPV 19. Os autores verificaram que a zona pelúcida de oócitos não fertilizados não foi efetiva como barreira à entrada de fragmentos do DNA exógeno no seu interior e que a absorção destes fragmentos pelo oócito foi passiva, independendo da presença de processos celulares ativos, uma vez que o grupo de oócitos fixados em formalina também absorveu estes fragmentos. Estas observações indicam a possibilidade do oócito atuar como meio de transmissão do HPV, embora os autores não tenham determinado se o DNA exógeno foi internalizado ou integrado no genoma do oócito.

Baseando-se no conceito da atuação dos gametas masculinos e femininos com vetores para a transmissão do HPV, vários estudos avaliaram a janela de oportunidade e os prováveis mecanismos de absorção e transferência do DNA viral aos embriões e às células do sistema reprodutivo feminino. Kadze et al. 55 analisaram a influência de diferentes temperaturas (4ºC, 37ºC e 40ºC) sobre a capacidade de adesão dos fragmentos de DNA do HPV do tipo 16 aos espermatozóides e o potencial de transferência destes fragmentos às células do cúmulus ooforus, derivadas das células da granulosa folicular, que são encontradas ao redor de cada oócito ovulado. O grupo de espermatozóides tratado a 37ºC foi associado à maior porcentagem de células do cumulus que se tornaram fluorescentes, sugerindo que a temperatura afeta a eficiência de transmissão do DNA exógeno às células alvo. O mecanismo de absorção dos fragmentos exógenos de DNA pelos espermatozóides envolveu uma cinética de ligação dos receptores (proteínas relacionadas aos genes classe II do complexo de histocompatilidade) identificados na membrana espermática, que é dependente da temperatura. Com relação às células do cúmulus, após 24 horas de co-incubação dos espermatozóides carreando os fragmentos fluorescentes de DNA do HPV, cerca de 52% a 68% destas células tornaram-se fluorescente. A fluorescência em cada célula do cúmulus encontrava-se distribuída de maneira homogênea em seus compartimentos citoplasmático e nuclear, o que poderia determinar a apoptose celular e, conseqüentemente, afetar de maneira negativa a íntima interação de troca de íons e pequenas moléculas entre o oócito e as células do cúmulus. Embora o mecanismo exato da transferência dos fragmentos de DNA exógeno do espermatozóide para as células do cúmulus permaneça desconhecido, especula-se que este evento poderia estar relacionado a um mecanismo de endocitose das células do cúmulus, pois se demonstrou anteriormente que as células somáticas têm a capacidade de englobar células espermáticas 7. Outro provável mecanismo seria a simples transferência de partículas, incluindo o DNA do HPV, da membrana espermática para a membrana das células do cumulus no momento do contato físico, seguido pela internalização deste DNA exógeno através de moléculas de CD4 presentes na membrana citoplasmática das células do cúmulus 61.

A hipótese de transferência dos fragmentos de DNA do HPV de espermatozóides infectados para as células do trato reprodutivo e embriões foi testada em um estudo experimental in vitro no qual células espermáticas humanas móveis, carreando fragmentos de DNA do HPV dos tipos 16 e 18, foram introduzidas na região cervical de úteros excisados de camundongos e a sua passagem através do trato reprodutivo foi rastreada pela identificação destes fragmentos em células endometriais e nas células de blastocistos em processo de hatching presentes na junção útero-tubárica 21. As células espermáticas foram capazes de transmitir os fragmentos de DNA exógeno do HPV dos tipos 16 e 18 aos blastocistos, após percorrer toda a cavidade uterina. Contudo, ao longo do caminho, apenas os fragmentos de DNA do HPV do tipo 18 foram transmitidos às células uterinas o que confirma que estes fragmentos foram efetivamente transmitidos pelos espermatozóides e não pela presença de fragmentos de DNA do HPV livres no meio de cultura. Caso a absorção do DNA tivesse ocorrido a partir do meio de cultura, os dois tipos de fragmentos de DNA do HPV teriam sido encontrados nas células uterinas. Adicionalmente, demonstrou-se através do tratamento das células com DNase que os fragmentos de DNA exógeno foram internalizados nas células dos blastocistos e nas células uterinas, o que poderia determinar um efeito negativo no mecanismo reprodutivo.

A demonstração da transmissão de fragmentos de DNA do HPV da membrana plasmática dos espermatozóides para a membrana plasmática das células do blastocisto indica o risco potencial de contaminação do embrião com o DNA exógeno na fase pré-implantacional da gestação inicial, na qual o blastocisto ainda estaria na trompa ou mesmo no útero. O efeito da duração da exposição aos espermatozóides carreadores de DNA exógeno in vitro e o destino deste DNA no interior das células dos blastocistos de camundongo foram avaliados por Chan et al. 22. Os autores observaram que as células dos blastocistos eram capazes de internalizar o DNA exógeno (fragmentos de DNA do HPV dos tipos 16, 18, 31 e 33) após uma curta exposição (1h). Contudo, notou-se que este DNA foi degradado no interior das células após um período de 24 horas e que os nucleotídeos resultantes deste processo poderiam determinar um comprometimento do desenvolvimento dos blastocistos 91. Em contraste ao grupo de curta exposição, o DNA do HPV dos tipos 16, 18 e 33 foi detectado no citoplasma das células dos blastocistos após sua exposição prolongada (24h) aos espermatozóides carreadores do DNA exógeno. Este fato poderia resultar tanto da absorção dinâmica de uma quantidade de DNA exógeno maior do que aquela que seria eliminada pelo processo intracelular natural de degradação como da incapacidade das enzimas intracelulares envolvidas na degradação do DNA, tais como a DNase I, de manipular um influxo contínuo de DNA do HPV. Do ponto de vista morfológico, o aspecto dos blastocistos permaneceu inalterado após a exposição curta ou prolongada ao DNA do HPV, indicando deste modo uma ausência de deterioração embrionária imediata. A exposição prolongada ao DNA exógeno pode resultar em sua transferência do compartimento celular citoplasmático para o nuclear e, uma relação direta entre o número de cópias de DNA exógeno presente no sítio de absorção e sua quantidade absorvida para o interior da célula foi observada. Contudo, não se sabe se em uma situação in vivo, o blastocisto estaria exposto aos espermatozóides carreadores de DNA exógeno em uma concentração e/ou período de tempo suficientes para exaurir a atividade citoplasmática da DNase, permitindo deste modo a migração do DNA exógeno ao núcleo celular e a sua integração ao genoma do hospedeiro. Com base nestes resultados, os autores sugeriram que somente a exposição prolongada do blastocisto aos espermatozóides carreadores de fragmentos de DNA do HPV seria efetiva para a transmissão de tipos específicos do DNA exógeno e que apesar de não se verificar uma alteração morfológica imediata do blastocisto após a sua exposição ao DNA do HPV, o desenvolvimento embrionário estaria comprometido devido aos produtos da degradação deste DNA no citoplasma celular.

A confirmação de que o DNA exógeno transferido do espermatozóide para as células do blastocisto pode se integrar ao genoma do hospedeiro 22 e que as células trofoblásticas embrionárias são o alvo preferencial do HPV do tipo 16 50 resultaram em estudos cujo objetivo foi avaliar possíveis diferenças na distribuição do DNA exógeno em células do trofoblasto ou em células que compõem a placa embrionária (inner cell mass) do blastocisto e os efeitos que o HPV teria sobre a integridade do DNA destas células embrionárias e desenvolvimento gestacional inicial. Em um estudo experimental observou-se que a exposição de blastocistos de camundongo em estágio de hatching a espermatozóides móveis, carreando fragmentos de DNA exógeno sintetizados a partir das regiões gênicas E6 e E7 do HPV dos tipos 16 e 18, por um curto período de tempo (2h), resultou em uma rápida distribuição do DNA exógeno aos dois tipos celulares que compõem o blastocisto 15. O tratamento dos blastocistos transfectados com DNase I demonstrou claramente que o DNA exógeno foi internalizado em suas células, mas o destino deste DNA no compartimento intracelular (integração no genoma nuclear ou mitocondrial do hospedeiro, formação de um epissoma ou destruição por endonucleases) ainda não foi elucidado apesar de estudos em outros tipos celulares indicarem que a região gênica E6-E7 do HPV é prontamente integrada no genoma hospedeiro.

Posteriormente, os dados de outro estudo in vitro, também utilizando blastocistos de camundongo, mostraram uma fragmentação significativa do DNA das células dos embriões expostas a fragmentos específicos de DNA do HPV 16. Neste caso, o DNA das regiões E6 e E7 do HPV do tipo 16 desencadeou um processo de apoptose celular nos blastocistos cerca de 24 horas após o início da exposição. Por outro lado, o DNA do HPV dos tipos 18, 31 e 33 não teve nenhum efeito em termos de fragmentação do DNA das células hospedeiras, sugerindo que os fragmentos de DNA destes tipos de HPV, através do seu mecanismo de ação, não foram capazes de romper a integridade do DNA das células dos blastocistos ou que estes fragmentos não foram absorvidos pelas células durante a endocitose. É interessante notar que neste estudo, como no citado acima, o aspecto dos blastocistos infectados com HPV não apresentou nenhuma diferença do ponto de vista morfológico em relação àquele dos blastocistos do grupo controle. A fragmentação excessiva do DNA dos blastocistos causada pelo DNA exógeno do HPV do tipo 16, desencadeando o mecanismo de apoptose celular, poderia ser um dos fatores envolvidos na perda embrionária ou no abortamento espontâneo inicial. Este resultado é consistente com a observação de uma prevalência três vezes maior de HPV do tipo 16 em material de abortamento espontâneo quando comparado a material de abortamento eletivo 49,50. Outro fator que poderia ser responsável pelo desenvolvimento embrionário anormal nesta situação estaria associado ao sítio de integração do DNA viral no DNA das células hospedeiras. Estudos utilizando diferentes linhagens celulares mostraram que a integração do DNA do HPV do tipo 16 ou 18 ocorre em regiões adjacentes a oncogenes que causam a transformação celular ou em regiões frágeis dos cromossomos, causando a interrupção gênica e a perda da heterozigocidade cromossômica 33,42,45,92.

Os eventos moleculares que acompanham a proliferação, maturação, diferenciação e morte de vários tipos celulares do trato reprodutivo feminino são regulados por proteínas relacionadas ao ciclo celular, tais como, as proteínas p53 e retinoblastoma (pRb), produtos dos genes supressores tumorais. Estas proteínas atuam como reguladores negativos do ciclo celular e são necessárias para que as células saiam deste ciclo e entrem em um estado de maior diferenciação 90. As proteínas p53 e pRb são detectadas em tecidos ovarianos (oócito, células da granulosa, células epiteliais da superfície ovariana), nas células epiteliais da ecto e endocérvix, do endométrio, das trompas de Falópio e no citotrofoblasto placentário, mas o padrão de sua expressão entre os tecidos e dentro das células varia de acordo com a atividade proliferativa e o estágio de diferenciação celular 13. A expressão das proteínas p53 e pRb é negativamente correlacionada com o grau de diferenciação celular. Na infecção pelo HPV, as onco-proteínas E6 e E7 podem ligar-se e, conseqüentemente, causar a perda da expressão das proteínas dos genes supressores tumorais p53 e pRb, determinado a diferenciação avançada dos vários tipos celulares do trato genital feminino, interferindo de maneira negativa na fisiologia reprodutiva normal quer por alterações do transporte e nutrição embrionária na trompa de Falópio quer por alteração da receptividade uterina.

Apenas dois estudos clínicos avaliaram a influência do HPV sobre a fertilidade em pacientes submetidas à FIVETE e os resultados foram conflitantes. Tanaka et al. 96 observaram uma prevalência baixa (5,5%) de infecção pelo HPV do tipo 16 em 192 pacientes submetidas à FIVETE e a identificação do DNA do HPV na cérvix uterina não teve nenhum impacto negativo sobre os parâmetros laboratoriais e clínicos destas pacientes. Recentemente, Spandorfer et al. 93 correlacionaram os resultados da pesquisa do HPV no colo uterino e dos ciclos de FIVETE em 84 pacientes inférteis. A incidência de resultado positivo para o HPV neste grupo de pacientes foi de 15,5% (13/84). A avaliação dos parâmetros laboratoriais das pacientes com resultado negativo ou positivo para o HPV não mostrou diferença significativa entre os grupos com relação ao número de oócitos recuperados, taxas de fertilização ou número e qualidade dos embriões transferidos. Contudo, as taxas de implantação e de gestação clínica foram significativamente menores no grupo positivo para o HPV, indicando um impacto negativo da presença deste vírus sobre os resultados dos ciclos de FIVETE.

HPV e Crio-preservação de Gametas e Embriões

Atualmente, os gametas masculinos e femininos e os embriões humanos são comumente crio-preservados em nitrogênio líquido utilizando-se paletas plásticas. Uma vez que esta paleta pode vazar ou se quebrar durante o congelamento ou perder o seu tampão de fechamento durante o descongelamento, o potencial para a contaminação viral do nitrogênio líquido representa um perigo real 24,98. Este risco pode ser ilustrado por um relato recente de transmissão da hepatite B a partir de um tanque de crio-preservação contaminado 98. Neste caso em particular, as amostras contaminadas eram de medula óssea e de células tronco do sangue periférico, porém é muito provável que isto possa ocorrer também durante a preservação de sêmen, oócitos ou embriões. Considerando-se que no caso dos espermatozóides o processo de absorção do DNA exógeno é rápido (cerca de 15 minutos) 41 e que no caso dos oócitos / embriões, a zona pelúcida não é efetiva como barreira à entrada de fragmentos de DNA exógeno no seu interior, sendo a absorção destes fragmentos pelo oócito passiva 19,78, torna-se evidente o risco de contaminação cruzada para o HPV nos reservatórios de armazenamento de gametas / embriões.

Os reservatórios de armazenamento contendo nitrogênio líquido representam ainda um problema que não foi completamente resolvido. Um grau mínimo de organização implica na necessidade de se evitar a mistura de amostras de pacientes infectados com aquelas da população não infectada. Com o objetivo de melhorar a segurança da crio-preservação, todos os pacientes e doadores cujos espermatozóides, oócitos ou embriões serão congelados deveriam ser rastreados para hepatites B e C, HIV, Treponema pallidum e, eventualmente o HPV. Nos casos de contaminação, nos quais o armazenamento de gametas e/ou embriões é considerado, recomenda-se que os materiais infectados sejam armazenados em reservatórios separados para cada tipo de infecção. Quando os gametas ou embriões são removidos do meio de cultura que os contém, a superfície externa da paleta pode tornar-se contaminada. O uso de cloramina a 0,5% para a descontaminação externa da paleta foi sugerido, mas sua eficácia não é totalmente confiável. Com relação aos materiais utilizados para manter os gametas e/ou embriões crio-preservados (paleta, tubo com tampa de rosca, ampola de vidro), verificou-se que todos apresentam riscos de vazamento ou quebra durante os processos de crio-preservação ou de descongelamento, sendo que um material de armazenamento não apresenta superioridade sobre o outro. Finalmente, os reservatórios de armazenamento devem ser periodicamente esvaziados e limpos 36,94.

Micro-manipulação de Gametas e de Embriões: Riscos Potenciais da Infecção pelo HPV

Desde o nascimento de Louise Brown, há quase três décadas, a FIVETE mostrou ser um procedimento eficiente e seguro para o tratamento da infertilidade de longa duração causada por diferentes etiologias tais como patologias tubáricas, andrológicas, endometriose e infertilidade sem causa aparente. Com o avanço tecnológico, cada vez mais procedimentos envolvendo a micro-manipulação de gametas e/ou embriões, incluindo a injeção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI), a abertura assistida da zona pelúcida, o diagnóstico genético pré-implantacional, a doação de citoplasma e a reconstituição de oócitos, são utilizados com o objetivo de aumentar as taxas de gestação 26,27,69,75,76. Em condições normais, a abertura da zona pelúcida ocorre quase simultaneamente à implantação, após a qual o embrião encontra-se relativamente protegido dos agentes externos. Contudo, quando a zona pelúcida é aberta no laboratório e/ou o embrião é transferido ao útero muito antes da janela de implantação, este pode ficar exposto a agentes que poderiam inserir um material genético exógeno em seu DNA cromossômico e determinar modificações genéticas da linhagem germinativa 44. A integração do DNA exógeno ao material cromossômico do hospedeiro pode variar de uma ausência de efeitos sobre o indivíduo até a indução de problemas graves de saúde, com a possibilidade de alteração da linhagem germinativa humana e a transmissão da doença para as gerações futuras.

No processo natural de fertilização, a reação acrossomal dos espermatozóides, a qual determina a perda de uma fração significativa da membrana externa da cabeça espermática, ocorre após a ligação destes à zona pelúcida, mas anteriormente à sua penetração, não predispondo desta maneira à integração do material genético exógeno. Por outro lado, com a técnica de ICSI, utilizada principalmente para o tratamento do fator masculino de infertilidade, o espermatozóide e um pequeno volume da solução presente ao seu redor são introduzidos diretamente no ooplasma, eliminando desta forma a barreira da zona pelúcida e tornando evidente o risco potencial desta técnica. Demonstrou-se experimentalmente a produção de uma proporção significativa de camundongos transgênicos (camundongos que apresentam a integração de DNA exógeno em sua linhagem germinativa) após a realização de ICSI utilizando-se espermatozóides misturados com DNA exógeno (proteína fluorescente verde ou beta-galactosidase) 80. Experimentos com camundongos transgênicos utilizando o papilomavírus bovino indicam quais os eventos que podem resultar da integração deste genoma no embrião. A injeção de um fragmento que representa cerca de dois terços do genoma do papilomavírus bovino em pró-núcleos de zigotos de camundongos resultou na produção de camundongos transgênicos e o vírus permaneceu aparentemente inativo nestes camundongos até a ocorrência de uma lesão epitelial 58. Neste caso, a lesão resultou no desenvolvimento de papilomas neste local, com produção de numerosas cópias extra-genômicas de fragmentos de DNA do papilomavírus bovino. Caso um evento similar envolvendo um vírus com potencial oncogênico como o HPV ocorresse em um embrião humano, o indivíduo afetado poderia desenvolver câncer ou mesmo alterações disseminadas nos tecidos epiteliais, todas as quais contendo o genoma viral. Em um estudo posterior, a injeção do DNA do citomegalovírus murino no pró-núcleo masculino dos zigotos de camundongos resultou em proles menores, retardo do desenvolvimento e anomalias fetais 6.

A introdução do DNA viral no citoplasma oocitário durante o ICSI poderia ter o mesmo efeito sobre o desenvolvimento embrionário e fetal do que aquele produzido pela micro-injeção do DNA viral no pró-núcleo masculino do zigoto. Contudo, os estudos experimentais abordando a introdução de elementos virais no citoplasma de oócitos foram incapazes de demonstrar tais alterações. Ivanova et al. 53 verificaram que a injeção do adenovírus no citoplasma de oócitos de camundongos e coelhos não teve nenhum efeito sobre o desenvolvimento embrionário e fetal. Posteriormente, Tebourbi et al. 97 avaliaram o efeito da introdução do citomegalovírus murino (forma completa e incompleta) no citoplasma de zigotos de camundongos sobre o desenvolvimento embrionário pré e pós-implantacional. Os autores observaram que embora o DNA viral tenha persistido em cerca de metade dos embriões e blastocistos, este não foi detectado e não determinou nenhum impacto no desenvolvimento posterior dos fetos ou dos recém-nascidos.

A utilização cada vez maior de procedimentos de micro-manipulação de gametas e/ou embriões nos laboratórios de reprodução assistida aumenta o risco para a introdução de material genético exógeno na linhagem germinativa humana. Em um laboratório de FIVETE, vários agentes infecciosos podem estar presentes e são introduzidos neste ambiente através do pessoal do laboratório ou mesmo a partir dos fluídos biológicos do casal em tratamento. Embora não existam evidencias de que este evento tenha ocorrido até o presente, deve-se ter em mente que as técnicas de micro-manipulação devem ser restritas aos casais que terão um maior benefício em sua utilização, evitando deste modo a exposição desnecessária dos casais aos riscos descritos acima.

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