Debora Rapaport

Estrutura viral
Papilomavirus são virus pequenos, não-envelopados, com forma icosahedral; são virus de DNA que se replicam no núcleo de células epiteliais escamosas. As partículas do papilomavirus apresentam diâmetro de 52 a 55nm (Fig. 2.1). As partículas virais consistem numa única molécula de DNA circular de dupla hélice de aproximadamente 8kb, contida numa proteína esférica, o capsídeo, que é composto por 72 capsômeros. O capsídeo é composto por 2 proteínas estruturais: a proteína de capsídeo maior (L1), de 55kD tamanho, da qual representa 80% da proteína total viral e a proteína menor (L2) de peso molecular de 70kD. Ambas as proteínas, L1 e L2, são viralmente codificadas. A L2 é importante para a encapsidação do DNA do virus em capsídeos virais e portanto, provoca o aumento da infectividade dos viriões do papilomavirus.

Fig. 2.1. Modelo tridimensional do virião do HPV1.

Genoma e organização do papilomavirus O genoma de vários papilomavirus, tanto animal quanto humano, já foram sequenciados e possuem uma organização genômica bastante similar. Os papilomavirus humanos (HPVs) são virus de DNA de dupla-hélice que induzem lesões hiperproliferativas do epitélio cutâneo e da mucosa. A Fig. 2.2A mostra o mapa genômico do BPV-1, que representa o protótipo da família de papilomavirus2. Uma característica comum entre os papilomavirus é a localização das ORFs numa mesma hélice do DNA viral. Estudos de transcrição revelaram que os RNAs são codificados por uma única hélice de DNA que serve como molde de transcrição.
A hélice de DNA que codifica o RNA contém aproximadamente 10 ORFs classificados em precoce (E) e tardio (L). O ORF E do genoma BPV-1 está localizado no fragmento que codifica a transformação celular (ORFs E1-E8). A região E do genoma viral é expressa em células infectadas não produtivas, além de células transformadas. Além disso, a região E codifica proteínas reguladoras virais, incluindo aquelas necessárias para a iniciação da replicação do DNA viral. Os ORFs L1 e L2 codificam proteínas do capsídeo e são expressas sómente em células produtivamente infectadas. A posição, o tamanho e a função de muitos dos ORFs são altamente conservados dentre os papilomavirus. Existe uma única região que não contém ORF. Tal região varia de tamanho entre os papilomavirus, esta chamada de região controladora longa (LRC), da qual compreende aproximadamente 1kb no genoma do BPV-1.

O genoma do HPV
O genoma de todos os HPVs contém aproximadamente 8 ORFs, que são transcritos em mensagens policistrônicas de uma única hélice de DNA (Fig. 2.2B). A região reguladora upstream (URR) concentra sequências reguladoras importantes na replicação viral e na transcrição. Assim como no BPV-1, a expressão gênica é dividida em precoce e tardia. No HPV-31, as proteínas precoces (E) são expressas pelo promotor P97, antes da replicação produtiva viral, enquanto as proteínas tardias (L) são expressas pelo promotor P742 durante a síntese de viriões.

Fig. 2.2. A. Mapa genômico do BPV-1.

Os números dentro do círculo indicam a posição dos nucleotídeos (bp). Sómente uma hélice de DNA é transcrita e a transcrição decorre no sentido do relógio. As regiões E e L indicam os ORFs (E1-E8; L1 e L2). LCR indica região controladora longa. P- indicam os promotores; A- indica o sítio de poliadenilação2. B. O genoma do HPV-31 de alto-risco. O diagrama indica genes E e L, a região reguladora upstream (URR), os 2 principais promotores que determinam a expressão gênica (P97 e P742) e 2 sítios de poliadenilação (AE 4140 e AL 7227). A transcrição decorre no sentido do relógio, representada pelas setas3.

As proteínas E1 e E2 são necessárias para a replicação viral do DNA e formam um complexo em torno da origem de replicação4. A E2 tem sido sugerida como um repressor do promotor viral precoce, funcionando como controle no mecanismo de replicação2. A E4 é expressa como proteína de fusão, com 5 aminoácidos da região N-terminal da E1 (fusão E1, E4) e parece estar envolvida em alterações da rede de citoesqueleto5. A função do gene E5 não é bem conhecida, provavelmente parece codificar uma proteína membranal com atividade transformadora fraca6. As proteínas E6 e E7 são as principais responsáveis pela transformação nos HPVs de alto-risco e atuam na modulação de atividades de proteínas celulares que regulam o ciclo celular7. Os genes tardios L1 e L2, como no BPV-1, codificam proteínas do capsídeo viral.

Biologia do papilomavirus
O papilomavirus induz tumores epiteliais e fibroepiteliais nos seus hospedeiros naturais, além de apresentar um tropismo específico em células epiteliais escamosas. A infecção produtiva do v?rus, dentro da célula hospedeira, pode ser dividida em 2 estágios, precoce e tardio. Tais estágios estão relacionados as etapas da diferenciação celular. As lesões causadas pelo HPV contém características histológicas fundamentais: A. Infecções cutâneas queratinizadas- aumento da epiderme, normalmente com presença de papilomatose; B. Grânulos de queratohialina- que são predominantes na camada do epitélio queratinizado e ocasionalmente predominante nas inclusões basofílicas intranucleares detectados na camada superior da epiderme. Tais características histológicas refletem as propriedades biológicas do papilomavirus sendo que as mudanças morfológicas são induzidas por produtos gênicos virais específicos.

O tropismo do HPV nas células epiteliais escamosas é evidenciado pelas funções de replicação viral; síntese vegetativa de DNA viral; produção de proteínas do capsídeo viral e formação dos viriões, dirigidos aos queratinócitos durante o processo de diferenciação. A Fig. 2.3 e a Tabela 2.1 mostram a relação entre a diferenciação do epitélio cutâneo normal escamoso e as atividades do papilomavirus durante a infecção produtiva de lesões benignas.

Fig. 2.3. A infecção do HPV e suas funções virais3.

Tabela 2.1. A diferenciação epitelial e as atividades virais do HPV durante sua infecção3

Diferenciação epitelial Atividades virais Stratum córneo Liberação de viriões maduros Proteínas tardias do capsídeo (L1 e L2) Stratum granuloso Amplificação vegetativa do DNA Altos níveis de proteínas precoces dependentes de diferenciação Stratum spinoso Diferenciação dependente de proteínas precoces E6, E1, E2, E4 e E5 Stratum basal Infecção primária Estabelecimento da replicação Proteínas precoces imediatas (E1, E2 e E5)

Uma vez que a célula basal é a única no epitélio escamoso capaz de se dividir, o virus infecta tal célula para induzir uma lesão persistente. Através de estudos de hibridação in situ, foi demonstrado que o DNA viral está presente em células basais e parabasais do papiloma8. Além disso, através de sondas de DNA da região precoce E, transcritos virais são encontrados nas células basais da epiderme.
A expressão gênica tardia, a síntese de proteínas do capsídeo, a síntese vegetativa do DNA e a formação de viriões, ocorrem sómente em células epiteliais escamososas em diferenciação terminal.

O ciclo de vida do HPV
O ciclo de vida produtivo dos HPVs está diretamente relacionado a diferenciação celular epitelial. A Fig. 2.4 mostra a diferenciação celular anormal do epitélio causada pela infecção do HPV, processo que é totalmente dependente da expressão de genes virais. Acredita-se que a infecção do papilomavirus ocorre através de microtraumas ocorridos no epitélio, expondo as células basais a entrada do virus. Seguido da entrada do virus nos queratinócitos, na camada basal, o genoma do HPV se estabelece como episomo, aproximadamente 50 cópias por célula, que por sua vez se replica em sincronia com o DNA da célula hospedeira2. O estabelecimento e a manutenção dos genomas do HPV estão associados a expressão dos genes precoces E6, E7 e E5, que codificam suas respectivas oncoproteínas, assim como as proteínas de replicação E1 e E2. Durante a divisão celular, as células basais deixam a camada basal, migram para a região suprabasal e começam a se diferenciar. Os queratinócitos, por sua vez, terminam seu ciclo celular logo que são destacados do pavimento membranal; as células infectadas por HPV entram na fase S do ciclo celular uma vez atingida a camada suprabasal9. A entrada na fase S resulta na amplificação de genomas virais em mil cópias por célula. Paralelamente a amplificação do DNA, existe a síntese das proteínas E1 e E4 juntamente com proteínas do capsídeo (L1 e L2), resultando na formação dos viriões infectivos. Subsequentemente, os viriões são liberados ao ambiente na camada superior, onde o epitélio é descamado.

Fig. 2.4. Infecção primária das células basais via microlesões. As atividades virais correspondentes a infecção produtiva do virus foram determinadas por estudos de hibridação in situ. A infecção viral ocorre na camada basal, normalmente através de microlesões da mucosa. As células infectadas se dividem e expandem lateralmente. Uma certa progênie migra dentro das camadas suprabasais onde genes virais são ativados, o DNA viral é replicado e as proteínas do capsídeo são formadas. Partículas virais são liberadas e podem infectar outros tecidos10.

O ciclo de replicação do papilomavirus está demonstrado na Fig. 2.5. Fig. 2.5. Ciclo de replicação do papilomavirus. Para o estabelecimento de um papiloma, o virus deve infectar uma célula epitelial basal. Na célula epitelial basal ocorrem as seguintes etapas: junção (1), invaginação da membrana (2), endocitose (3) e transporte do núcleo e desenvelopar o DNA viral (4). Transcrição da região precoce E (5), tradução das proteínas precoces (6) e steady-state da replicação do DNA viral (7) ocorrem na célula basal e na célula infectada epitelial suprabasal. Eventos no ciclo de vida viral levam a produção de partículas de viriões da qual ocorrem no queratinócito diferenciado; DNA de replicação viral (8), transcrição da região tardia L (9), produção de proteínas de capsídeo L1 e L2 (10), concentração de partículas de viriões (11), quebra de DNA (12), liberação do virus (13) 2.

Nas lesões cervicais não cancerosas, o genoma do HPV é encontrado exclusivamente na forma de episomos. Porém, em carcinomas cervicais, os genomas de HPV de alto-risco são encontrados na forma integrada no DNA da célula hospedeira. A integração do DNA viral, representada na Fig. 2.6, é uma etapa que acelera o processo de malignidade em câncer cervical, onde frequentemente ocorre a ruptura da região E2. Uma vez rompida a função inibidora da E2, sob o promoter viral da E6 e E7, altos níveis de expressão da E6 e E7 são observados, levando a transformação celular e, resultando eventualmente em câncer11.

Fig. 2.6. A integração viral na célula hospedeira acelera o progresso da malignidade.As ORFs precoces e tardias da forma integrada do HPV-31 estão indicadas. A integração normalmente provoca a ruptura da ORF E23.

Junção, entrada e desintegração do envelope
O primeiro passo da infecção viral é a junção do virião com a célula. Os receptores pelos quais o papilomavirus se liga e entra nas células não foram ainda identificados. Estudos recentes indicam que a expressão da integrina-?6, em uma linhagem celular negativa para tal proteína, é suficiente para conferir ligação entre o papilomavirus e a célula, mostrando evidências de que a integrina-?6 seria um candidato-receptor do virus do papiloma12. A integrina-?6 é uma proteína conservada em várias espécies de papilomavirus.

Estudos em BPV-1 demonstram que a entrada de viriões é completada em 90 minutos, sendo que a maioria dos antígenos para os capsídeos estão localizados no núcleo. As partículas virais são transportadas em fagossomos e sua entrada e transporte podem ser inibidos pelas drogas citochalasina B e paclitaxel (Taxol), sugerindo o possível envolvimento de microfilamentos e microtúbulos nesse processo. A junção a membrana plasmática e a endocitose, entrada dos viriões nas vesículas citoplasmáticas, podem ser monitorados por microscopia eletrônica. Nenhum virião completo foi observado no núcleo de células infetadas, apesar de certa fluorescência ter sido constatada para as proteínas L1 e L2. Essa observação sugere que a desintegração dos viriões ocorre no citoplasma e que as proteínas L1 e L2 podem migrar ao núcleo através do sinal de localização nuclear (NLS) 13.

Pouco se conhece sobre a formação do papilomavirus e sua liberação. Partículas virais são observadas na camada granular do epitélio e não em camadas mais profundas. Tudo indica que o virus não é citolítico.

Transcrição
Historicamente, o BVP-1 tem sido o protótipo de análise de transcrição do papilomavirus. A transcrição do papilomavirus é baseada em múltiplos promotores, em padrões de splicing alternados na produção de diferentes espécies de RNA mensageiros (RNAm) em diferentes células. Seis dos promotores transcricionais do BPV-1 são ativos em células transformadas. Nos HPVs, múltiplos promotores estão envolvidos na formação de vários tipos de RNAm. Por exemplo, para o HPV-31, o promotor P97 (nucleotídeo posição 97) é o promotor dominante ativo em células diferenciadas não terminais. Tal promotor direciona a expressão das proteínas E6 e E7, análogo ao P97 do HPV-16 e P105 do HPV-18. A Fig. 2.7 representa o mapa de transcrição do HPV-16.

Fig. 2.7. Mapa de transcrição do HPV-16. Organização simplificada (linearizada) do HPV-16. Os retângulos representam as ORFs e suas respectivas posições. Os genes E codificam proteínas precoces na infecção (proteínas não-estrururais) e os genes L codificam proteínas tardias (necessárias para a formação do virião). http://ethesis.helsinki.fi./

Os elementos cis
O genoma do papilomavirus contém múltiplos elementos cis que codificam fatores reguladores transcricionais dos quais modulam a expressão gênica viral. A região LCR contém elementos enhancers que são responsivos a fatores celulares. Os enhancers são específicos a certos tipos celulares, essenciais para a expressão inicial de genes virais após a infecção viral, além de serem importantes para a manutenção da latência viral.

Proteínas reguladoras E2
Os produtos gênicos E2 do papilomavirus são fatores reguladores de transcrição viral e replicação. E2 são proteínas conservadas entre os papilomavirus e contém 2 domínios: domínio de ligação do DNA e dimerização da proteína (localizado na região C-terminal); e domínio transativo (localizado na região amino-terminal). A ativação ou a repressão da transcrição, direcionada pela proteína E2, depende da posição e proximidade dos sítios de ligação-E2 em relação ao promotor.

Mutações da ORF E2 do BPV-1 tem efeito pleiotrópico no vírus, rompendo a transformação, a replicação e as funções de regulação transcricional. Estudos demonstraram que a expressão de genes da região precoce estão sob controle do produto gênico E2 através de elementos E2 responsivos localizados na LCR viral. O genoma do BPV-1 contém 17 sítios de ligação de E2, dentre eles 12 estão localizados na LCR.

A ligação da E2 nos seus sítios específicos, situados na região LCR dos genomas HPVs, resultam na modulação da atividade do promotor viral. Análises da atividade do promotor P97 do HPV-16 e P105 do HPV-18 mostraram que estes possuem uma atividade basal que pode ser reprimida pelos produtos gênicos da E2. Experimentos de imortalização de queratinócitos do HPV-16, dependentes da expressão dos genes E6 e E7, demonstraram que a expressão do gene E2 diminui a eficiência da imortalização. A E2 pode também diminuir o crescimento de cultura de células derivadas de HPV-cervical através da repressão dos genes virais E6 e E714.

A E2 é uma proteína multifuncional. Esta pode funcionar como ativador transcricional ou como repressor, que é mediado através de interações com fatores celulares específicos (TATA-proteína de ligação e AMF-1). A E2 também é importante na replicação do DNA viral e na manutenção do plasmídeo. A E2 forma um complexo com a E1, no BPV-1 e aumenta a afinidade da E1 de se ligar a origem de replicação.
A função da E2 também está descrita no subcapítulo 2.4.7.

A manutenção de plasmídeos dos quais contém origem de replicação de papilomavirus, requisitam um elemento cis num microcromossomo que consiste em sítios múltiplos de ligação da E2. A E2 parece ter um papel na ligação dos plasmídeos virais aos cromossomos mitóticos celulares, garantindo que genomas virais sejam inseridos dentro do núcleo durante a telófase15.

Expressão gênica tardia
As funções tardias do papilomavirus incluem: 1. síntese vegetativa de DNA viral; 2. síntese das proteínas do capsídeo e; 3. elaboração do virião, da qual ocorre exclusivamente em queratinócitos diferenciados. A regulação da transcrição de genes tardios é mais estudada nos virus BPV-1, HPV-11, -16 e -31. Em cada um deles, existe um promotor específico que se torna ativo sómente na diferenciação terminal de queratinócitos. Para o BPV-1, RNAs tardios são transcritos pelo promotor tardio PL, localizado na região 5′ da LCR. Ambos os genes L1 e L2 são expressos em RNAs transcritos pelo PL. Embora o gene E4 esteja localizado na região precoce, este codifica uma proteína tardia, também controlada pelo promotor PL. No caso dos HPVs, os promotores tardios não se localizam na região LCR.

A poliadenilação dos RNAm L1 e L2 do BPV-1 ocorrem na região 3′ da ORF L1 (nucleotídeo 7175), sítio que não é usado em células transformadas e portanto, é considerado como sítio de poli-A tardio. Nos HPV, a poliadenilação dos RNAm ocorre numa região similar de seu genoma (3′ da ORF L1).

A expressão dos genes L1 e L2 é regulada em um nível pós-transcricional. Existem elementos cis-acting descritos para o BPV-1, HPV-6 e HPV-1, que atuam na regulação da expressão gênica para tais vírus de uma forma pós-transcricional.

As proteínas E4
O ORF4 do papilomavirus se localiza na região precoce E, porém, o gene é expresso de forma tardia e tem papel na infecção produtiva. O E4 sobrepõe-se com a ORF E2 em um esquadro de leitura diferente e portanto, codifica uma proteína totalmente diferente com diferente sequência de aminoácidos. Normalmente, a sequência do gene E4 não se encontra conservada entre os papilomavirus. O transcrito viral é formado através de splicing, incluindo poucos codons do começo da E1 continuando para o E4, e este forma o maior RNA já encontrado nas lesões induzidas por HPV. Em papilomas, a proteína E4 é expressa primeiramente em epitélio em diferenciação, além de ser expressa em células onde o DNA viral é replicado de forma vegetativa9. A expressão da proteína E4 não coincide com a expressão das proteínas do capsídeo e precede a expressão da L1. Apesar da E4 ser encontrada em altos níveis em tecidos infectados, sua função não é exatamente conhecida. A E4 não é encontrada em partículas de viriões. Análise de mutações mostraram que o gene E4 do BPV-1 não é essencial para a transformação viral ou para a replicação viral. A E4 do HPV tem a função de induzir o colapso da rede de citoqueratina, sendo que esta auxilia a liberação do vírus da célula hospedeira16.

A replicação do DNA viral
O papilomavirus apresenta 3 modos de replicação de DNA: 1. O primeiro ocorre durante o início da infecção de um queratinócito basal, onde existe a amplificação do genoma viral de 50 a 100 cópias. Pouco se sabe sobre esta etapa. 2. A fase da manutenção do genoma, que ocorre em células basais em divisão, na porção profunda da epiderme (fibroblastos dermais em fibropapilomas). O DNA viral é mantido na forma de plasmídeo de multicópia estável (Fig. 2.5). O genoma viral se replica, em média, uma única vez durante a fase S (síntese) do ciclo celular, sempre em sincronia com os cromossomos da célula hospedeira. Posteriormente, o genoma é divido em células-filhas. Este tipo de replicação de DNA garante a infecção persistente e latente nas células que originam a epiderme (stem cells). 3. A replicação vegetativa de DNA, que ocorre nas células epiteliais bem diferenciadas do papiloma. Nessas células, não há síntese de DNA, observa-se quebra de DNA viral, gerando genomas que são empacotados na progênie viral.

Manutenção do plasmídeo
A manutenção do plasmídeo tem sido estudada em células “transformadas” de camundongo BPV-1, onde o genoma viral está na forma de plasmídeo estável de multicópia17. Este sistema serve de modelo para estudos de replicação vegetativa do DNA viral e tal modelo seria análogo a replicação de plasmídeos estáveis vistos em fibroblastos dermais de fibropapiloma e queratinócitos basais em lesões associadas a papilomavirus. Durante a fase de manutenção, o número de cópias do genoma viral mantém-se relativamente constante por muitas gerações celulares.

Origem de replicação de DNA
A origem de replicação de DNA do BPV-1 se localiza na região LCR. A origem de replicação deve estar na posição cis enquanto as proteínas E1 e E2 na posição trans. A origem de replicação de tamanho mínimo se encontra entre os nucleotídeos 7911-7927 e contém uma região rica em A+T (ATR), e um sítio de ligação para a E1 e para a E2. A origem de replicação também já foi mapeada em vários HPVs, e esta também contém uma região ATR e um sítio de ligação para a E2.

A proteína E1
Estudos genéticos demonstraram que a replicação do plasmídeo estável BPV-1 depende da expressão das proteínas virais E1 e E2. Porém, a proteína E1 é o único fator viral diretamente envolvido na replicação do plasmídeo. A E2 funciona como auxiliar na replicação e na manutenção do plasmídeo. A proteína E1 é a maior ORF do genoma do papilomavirus e é relativamente bem conservada entre os papilomavirus. A proteína E1 tem uma estrutura similar ao SV40 antígeno de tumor (TAg), constituindo uma proteína essencial para a replicação do vírus. A E1 do BPV-1 é uma fosfoproteína nuclear de 68kD que se liga especialmente a origem de replicação18. A ligação entre a E1 e a origem de replicação é de baixa afinidade, porém, o complexo é estabilizado pela interação da E2, que se liga a sítios adjacentes a origem de replicação19. A E1 é requisitada tanto para a iniciação quanto para o elongamento do DNA viral. A E1 é uma proteína que tem atividade de ATPase dependente de DNA e helicase de DNA. A Fig. 2.8 mostra o esquema da E1 do BPV-1.

Fig. 2.8. Esquema da proteína E1 do papilomavirus. A proteína E1 possui um domínio que se liga ao DNA mapeado entre os resíduos 159 a 303 e também possui atividades ATPase e helicase2.

Além da interação entre E1 e E2, a proteína E1 também interage com a subunidade p180 da DNA polimerase ?-primase celular para o recrutamento da máquina de replicação do DNA celular designado a replicação viral. Além disso, a E1 interage e se liga a Ubc9 que é necessária para a eficiência da replicação dependente da origem20. E1 é uma proteína SUMO-1 modificada pela Ubc-9 e, tal modificação é requisitada para o acúmulo intranuclear da E121.

A função da proteína E2
Como descrito acima, a replicação do DNA do papilomavirus também necessita da proteína viral E2. A E2 interage com a E1 e aumenta a habilidade da E1 se ligar a origem de replicação (demonstrado por experimentos de replicação in vitro em HPV e BPV-1) 22. O complexo E1:E2 é precursor de um grande complexo multimérico, que após a retirada da E2, existe a distorção da origem de replicação e o DNA é liberado para iniciar a replicação. A E2 serve como um fator auxiliar que funciona na pré-iniciação do complexo na origem de replicação; a E2 sozinha não tem nenhuma atividade funcional na replicação do DNA viral.

Replicação do plasmídeo e replicação vegetativa do DNA viral
Durante os estágios iniciais da infecção do papilomavirus, o genoma viral é amplificado por um período curto. Em seguida, existe a transição para o estágio de manutenção, onde os plasmídeos se replicam, em média, uma cópia por ciclo celular, de uma maneira análoga ao cromossomo celular.

A replicação vegetativa do DNA do papilomavirus é necessária para gerar genomas que serão empacotados em viriões, processo este que ocorre somente nas células epiteliais em diferenciação terminal do papiloma. O mecanismo que regula a mudança da fase episomal a replicação vegetativa ainda não é conhecido. Esta mudança pode envolver a presença ou ausência de fatores celulares que controlam a diferenciação em queratinócitos. Fatores virais como a E1 e a E2 (ou seus modificadores) podem modificar o estágio de diferenciação dos queratinócitos. Altos níveis de replicação de DNA do BPV-1 ocorrem em células transformadas após parada de crescimento, num processo onde ambas E1 e E2 estão envolvidas23. Estudos futuros direcionados a replicação vegetativa do DNA viral são extremamente necessários.

Transformação celular maligna do virus
A tumorgenicidade é induzida por alterações do DNA, uma delas, a integração do DNA viral no genoma do hospedeiro (Fig. 2.6). O sinal de transdução ocorre constitutivamente na célula, e agentes como ligantes e receptores membranais iniciam a ativação de uma cascada de eventos que controlam o ciclo celular, o crescimento, a promoção de apoptose e a inibição de angiogênese. O balanço entre a inibição e a ativação de tais sinais é a chave do processo de transdução. A ligação dos ligantes aos seus respectivos receptores, quando elongada, podem provocar mudanças no ciclo celular, i.e., crescimento anormal e transformação celular.

Mais de 100 tipos de HPV já foram identificados, aproximadamente 30 infectam especificamente o epitélio genital10. Alguns tipos de HPVs, como os tipos 6 e 11, induzem sómente lesões benignas no trato genital. Estes são referidos como virus de baixo-risco, uma vez que provocam malignidade das lesões em baixa frequência. Do contrário, HPVs de alto-risco estão associados a uma alta frequência de desenvolvimento de lesões malignas. Aproximadamente 99% de câncer cervical contém DNA de HPV do tipo de alto-risco24, sendo que o HPV-16 é o mais frequente, seguido dos tipos 18, 31, 33 e 4525. Geralmente infecções persistentes do HPV de alto-risco é o fator mais importante de desenvolvimento de neoplasia cervical26.

Alguns papilomavirus são capazes de induzir transformação celular em cultura de células. O papilomavirus mais estudado quanto a transformação celular é o BPV-1. A transformação celular, em cultura de células, foi primeiramente descrita na década de 60. No final da década de 70, experimentos de transformação celular foram estabelecidos em cultura de células com as linhagens celulares de camundongo, NIH-3T3 e C127 e, outras linhagens de rato e hamster. A transformação da C127 além de causar alterações morfológicas, também causa perda de inibição de contato celular (independência de se fixar) e provoca tumorgenicidade em camundongo do tipo nude*. Uma característica interessante da transformação do BPV-1 é que o DNA viral é mantido em multicópia em forma de plasmídeo estável.

A integração do DNA viral no genoma do hospedeiro não é essencial para a iniciação ou manutenção da transformação celular. Porém, a transformação é dependente da expressão do DNA viral, evidenciado pela perda do fenótipo de células transformadas em células de camundongo que foram tratadas com interferon, droga que provoca a inibição de síntese de DNA viral.

O virus BPV-1 apresenta 3 proteínas responsáveis pela transformação da célula, codificadas pelas ORFs E5, E6 e E7. Os 3 genes estão contidos em um fragmento que contém 69% do genoma viral do BPV-1. No BPV-1, o E5 é o principal gene responsável pela transformação celular e é altamente conservado entre os papilomavirus. Este também age na proliferação de fibroblastos dermais no fibropapiloma. Além dos genes E5, E6 e E7, que estão diretamente envolvidos na transformação do BPV-1, a região precoce também codifica genes indiretamente responsáveis pela transformação celular. Estes são os genes E1 e E2, envolvidos na regulação da transcrição e na iniciação da replicação do DNA viral. Porém, o vírus é altamente dependente de fatores celulares do hospedeiro, incluindo a DNA polimerase-? e a timidina-quinase.

Transformação e imortalização do HPV
Os genomas HPV-16 e HPV-18 não são tão eficientes para induzir transformação como o virus BPV-1 em células de roedores. Entretanto, experimentos alternativos como cotransfecção de DNA com marcadores de seleção dominante (como o gene resistente para *Nude- modelo animal para estudos de câncer. O camundongo nude é assim denominado por não apresentar pêlo. Além disso, ele não apresenta timo. Esta caracteristica é resultante da homozigose do gene recessive mutante nu. Uma vez que o timo é ausente, o nude não produz linfócitos T maduros, portanto, ele não é capaz de produzir respostas imunes como: formação de anticorpos que necessitam de células T helper CD4+; resposta immune dependentes de CD4+ e/ou CD8+. A ausência da função de células T previni o nude de rejeições de alografos e xenografos, i.e., tecidos de outras espécies.

neomicina) e seleção bioquímica para células transfectadas, permitem que o HPV-16 e HPV-18 transformem células de roedores. Nesses experimentos, tais virus de alto risco transformam células, porém, virus de baixo-risco (como HPV-6 e HPV-11) não provocam tal transformação.

A habilidade das infecções do HPV induzir malignidade está atribuída a função das proteínas E6 e E7, das quais agem na manipulação dos reguladores do ciclo celular. A expressão da E6 e E7 de HPVs de alto-risco é suficiente para induzir imortalização de células HFK em cultura27. Entretanto, estas células não são tumorigênicas em camundongos nude e necessitam de eventos celulares adicionais, como a presença do oncogene ativador ras28 ou então passagens celulares seriais em cultura, tornando tais culturas celulares completamente transformadas. Tais observações mimitizam o processo de indução de tumorgenicidade do HPV, a partir de uma infecção inicial até a transformação maligna in vivo. Do contrário, proteínas E6 e E7 de HPVs de baixo-risco, não são capazes de imortalizar queratinócitos in vivo, porém, estas são capazes de estender a longevidade celular29.

Como descrito acima, o DNA de virus de alto-risco é distinto do DNA de virus de baixo-risco, uma vez que, os de alto-risco provocam a imortalização de cultura de fibroblastos humanas (queratinócitos e células epiteliais cervicais). As linhagens celulares derivadas de tal imortalização, em camundongos nude, não são tumorigênicas, porém, pssuem alterações nas suas características de crescimento e são resistentes a sinais de terminação de diferenciação. Todos os tipos de HPV do trato genital (HPV-6,-11, -16 e -18) são capazes de induzir transientemente proliferação celular, mas somente os virus de alto-risco provocam a imortalização celular.

A oncoproteína E5
A E5 do BPV-1 é uma proteína transmembranal de 44 aminoácidos. A E5 é uma proteína integral associada a membranas intracelulares e é composta por 2 domínios: um segmento hidrofóbico localizado na porção amino-terminal, responsável pela localização das frações membranais; o domínio hidrofílico, localizado na região C-terminal. Estudos mostraram que em células transformadas, a E5 forma um homodímero que se localiza no complexo de Golgi e no retículo endoplasmático. Existem 2 cisteínas que são importantes na formação deste dímero, do qual é requisitado para a transformação celular. A proteína E5 não possui atividade enzimática intrínsica, esta altera a atividade celular de proteínas membranais envolvidas na proliferação. Isto é, a E5 afeta a atividade e metabolismo de receptores para fatores de crescimento. A E5 juntamente com o EGF e o receptor colônia estimulante fator I para estimulação, provocam a transformação de células NIH-3T3. O primeiro alvo da proteína E5 do BPV-1 é o PDGF-?? endógeno. Existe um aumento dos níveis da fosforilação da tirosina do receptor PDGF-? endógeno em células de roedores transformadas por E5. A E5 ativa o receptor e transforma células de uma maneira ligante-receptor independente. O mecanismo de ativação da E5 do receptor PDGF-? envolve a formação de um complexo ligante-receptor, induzindo a dimerização do receptor, transfosforilação dos resíduos de tirosina no domínio citoplasmático da proteína do receptor e recrutamento do domínio SH2-contendo proteínas para o complexo de sinal de transdução. Além disso, as subunidades do dímero E5 se ligam a 2 moléculas do receptor PDGF-? ?resultando na dimerização e ativação do receptor. Além disso, através de análise de mutações, foi demonstrado que mutações nas cisteínas 37 e 39 da E5, a glutamina 17 e o ácido aspártico 33, inibem a formação do complexo E5-PDGF ?-receptor e, consequentemente prevenindo a transformação celular.

Estudos evidenciaram que o gene E5 do HPV-16 pode induzir uma certa transformação em NIH-3T3, porém, a função específica da E5 ainda não é conhecida, uma vez que seu DNA não é mantido em células de camundongo transformadas. Contrariamente, a proteína E5 do BPV, a proteína E5 do HPV exibe uma atividade transformante fraca30.

A proteína E5 induz transformação em linhagens de fibroblastos de camundongo ou queratinócitos, provocando aumento da capacidade proliferativa e estímulo de síntese de DNA celular (observado em queratinócitos humanos dependentes de EGF). A E5 do HPV-16 se localiza no complexo de Golgi, nos endosomos e na membrana celular. A E5 está associada a ativação do receptor EGF e a ativação da quinase MAP. A E5 do HPV-16 se liga a subunidade 16kD da proteína vacuolar ATPase e inibe a acidificação dos endosomos, inibindo assim a degradação do virus. Deve-se notar que a E5 não se expressa na maioria das lesões positivas para o HPV, sugerindo que o gene estimula proliferação in vivo. Provavelmente, o gene da E5 age em papilomas benignos e não em câncer. Este também participa da iniciação do processo carcinogênico e de outros aspectos da interação celular hospedeiro-virus, relevantes à patogênese da infecção do HPV.

Outros estudos demonstraram que a expressão da E5 resulta no aumento dos níveis de fosforilação do EGFR de uma maneira dependente ligante-receptor, levando ao aumento de sinais mitogênicos. Sugere-se que a proteína E5 do HPV age nas fases tardias do ciclo de vida viral, provavelmente em conjunto com a proteína E7, para a progressão do ciclo celular31.

A oncoproteína E6 do HPV
Embora a proteína E7 do HPV-16 seja suficiente para o estabelecimento da transformação das células NIH-3T3 e transformar células de fígado de rato juntamente com a ras, a E6 e E7 juntas, estendem a duração de vida de queratinócitos humanos e levam a imortalização de clones que são resistentes a diferenciação terminal. Esta propriedade é dependente do tamanho do gene E6, uma vez que estudos de mutação demonstraram que a forma truncada da proteína E6 do HPV-16 não provoca tal função.

O E6 é um dos primeiros genes expressos na infecção do HPV e este possui um papel importante na imortalização celular32. O E6 sózinho não é capaz de imortalizar células HFK, este age juntamente com o gene E7 que induz mudanças no comportamento celular, como a imortalização33. As proteínas E6 não possuem atividade enzimática intrínsica, portanto se utilizam de interações com proteínas celulares para que exerçam suas funções. A E6 é uma proteína de 150 aminoácidos contidos em 4 motivos C-x-x-C, dos quais formam 2 domínios que se ligam ao zinco. Uma função bastante importante da proteína E6 de virus de alto-risco é sua ligação ao supressor de tumor p53, resultando em sua degradação mediada por ubiquitina. A p53 é uma proteína com sítio-específico de ligação de DNA que é expressa em resposta a agentes genotóxicos ou citotóxicos que provocam a instabilidade genômica, resultando na parada do ciclo celular ou apoptose34. O p53 é um ativador transcricional que regula o crescimento celular e a supressão de crescimento de tumores (Fig. 2.9).

Fig. 2.9. Funções do p53 na infecção viral do HPV. O nível do p53 é relativamente baixo em células primárias. Agentes que danificam o DNA, a infecção viral e a expressão da proteína E7, aumentam os níveis de p53. Níveis elevados de p53 levam a apoptose ou a interrupção de pontos de chequada do ciclo celular na fase G1, através da ativação transcricional de bax ou p21. Oncoproteínas virais podem interferir nesta função reguladora “negativa” do p53, tanto no sequestro de p53 na formação de um complexo estável porém, não-funcional, quanto na ubiquitinação e aumento da proteólise, observado nas proteínas E6 de HPVs de alto-risco2.

Uma vez que o HPV depende da máquina de síntese de DNA celular e deve estimular a fase S do ciclo celular para a replicação de seu genoma, a superexpressão da p53 representa um grande impedimento na replicação viral35. Para degradar p53, as proteínas E6 de HPVs de alto-risco se ligam a ligase da ubiquitina celular, a proteína E6, então associada (E6-AP), é capaz de se ligar a proteína p53. A E6-AP recruta o complexo enzimático da ubiquitina (composto por 3 enzimas: UE1- enzima ativadora da ubiquitina; UE2- enzima conjugadora; UE3- ligase da ubiquitina-proteína alvo), que por sua vez, ubiquitina as lisinas da p53, iniciando sua proteólise através do proteasomo. A ubiquitina é primeiramente ativada numa reação dependente de ATP e transferida da UE1 a UE2. Posteriormente, a ubiquitina é transportada aos resíduos de lisina da proteína com o auxílio da UE3. Este complexo, por sua vez, ubiquitina as lisinas da p53, proteínas multi-ubiquitinadas são reconhecidas e degradadas pelo proteasomo36. A degradação da p53, pela E6 de alto-risco, resulta no contorno dos sinais de parada de crescimento celular normal; pontos de chequada G1/S e G2/M não são verificados, levando a aquisição de inúmeras alterações genéticas que contribuem para a transformação celular, i.e., malignidade. Portanto, a E6 da HPV apresenta atividade anti-apoptótica e pode interferir nas funções reguladoras do ciclo celular da p532 (Fig. 2.9).

Além disso, a degradação da p53 é também provocada pela ativação da telomerase, através das proteínas E6 dos HPVs de alto-risco. Telomerase é uma enzima constituída de multisubunidades responsável pela replicação do DNA telomérico nas extremidades dos cromossomos37. Na maioria das células somáticas normais, a atividade da telomerase está ausente, o que resulta na perda gradual de telômeros através de sucessivas divisões celulares. Tem sido sugerido que a diminuição dos telômeros inicia o processo de senilidade e morte celular38. Do contrário, a maioria das células tumorais mantém o comprimento dos telômeros e a atividade da telomerase. A regulação da telomerase é controlada pela expressão da telomerase humana de transcrição reversa (hTert), que codifica a subunidade catalítica da telomerase. Recentemente, observou-se que a expressão da hTert é suficiente para induzir imortalização de fibroblastos, mas não dos hospedeiros naturais do HPV, os queratinócitos. O mecanismo preciso da ativação da telomerase através da E6 ainda não é conhecido, porém, estudos mostraram que a E6 pode aumentar os níveis endógenos de hTert nos queratinócitos através da ativação do seu promotor39. O interessante é que tal mecanismo é independente do p53 e envolve o ativador myc40.

A expressão da E6 regula outro mecanismo relacionado a transformação, independente do p53. Proteínas E6 de HPVs de alto-risco possuem o motivo PDZ na região C-terminal. Estudos evidenciaram que as proteínas com o domínio PDZ estão envolvidas na oncogênese e regulam sinais de transdução. Estudos de mutação no domínio PDZ da E6 mostraram perda da capacidade de transformação41.

A oncoproteína E7 do HPV
Como descrito acima, a proteína E7 juntamente com a proteína E6, promovem a transformação dos HPVs. A expressão da proteína E7, na ausência de outros produtos gênicos virais, leva a transformação de fibroblastos de roedores. A expressão da E7, sozinha induz imortalização de queratinócitos humanos, porém, na presença da proteína E6 existe o aumento de tal evento42. Proteínas E7 de HPVs de alto-risco são nucleares, contendo aproximadamente 100 aminoácidos que formam dímeros através do motivo de zinco localizado na região C-terminal2. A atividade inicial da E7 e sua associação à membros da família do gene do retinoblastoma (Rb- gene repressor de tumor), facilita a progressão do ciclo celular dentro da fase S. As proteínas Rb apresentam papel importante na regulação do ciclo celular, promovendo a transição da fase G1 a S. Em células normais, a Rb é hipofosforilada durante as fases G0 e G1 e torna-se altamente fosforilada durante as fases S, G2 e M. A pRb tornando-se fosforilada em múltiplos resíduos de serina, através das quinases dependentes de ciclina (cdk), da fase G1 para S, mantendo-se nesta forma até o final da fase M, onde torna-se novamente hipofosforilada através de fosfatases.

A Rb na forma hipofosforilada se liga ao fator de transcrição E2F e reprime a transcrição de promotores contendo sítios E2F. Muitos genes necessários a síntese de DNA, (como a DNA polimerase-? e a timidina-quinase), são transcritos de uma maneira dependente do ciclo celular e regulados pelo E2F (Fig. 2.10). Através da ligação da Rb hipofosforilada, a E7 impede que esta se ligue ao E2F, e portanto promove a continuação do ciclo celular43. Em epitélio normal, a parada do ciclo celular, ocorre através do sinal de diferenciação, que é altamente regulado pela proteína Rb. A ligação da E7 com a pRb, promove a continuação do ciclo celular de células epiteliais já diferenciadas, permitindo a replicação de genes do HPV. Além disso, a E7 induz a degradação da Rb através da ubiquitina, o que contorna a regulação da interrupção do ciclo celular44. Interessante é que a E7 de HPVs de baixo-risco também são capazes de se ligar a Rb (porém, 10 vezes menos eficiente que a E7 de alto-risco) e, contrariamente a E7 de alto-risco, as proteínas E7 de baixo-risco falham na indução de sua degradação. Estudos com proteínas quiméricas (entre E7 de HPV de alto-risco e de baixo-risco), mostraram que a diferença na eficiência da transformação em células de roedores é devido ao sítio de ligação com a Rb (que compreende a mudança de um único aminoácido). Paralelamente a Rb, a E7 interage com outras 2 proteínas da mesma família (p107 e p130), das quais regulam de forma negativa a transcrição E2F45.

Fig. 2.10. A proteína E7 contorna a regulação do ciclo celular mediado pela Rb (e proteínas associadas p107 e p130). Durante o ciclo celular, a pRb é fosforilada (ppRb) e a forma não-fosforilada é detectada sómente nas fases G0/G1. A Rb não-fosforilada é a forma ativa que age como um regulador negativo do ciclo celular. Durante a transcrição, fase S, a Rb é fosforilada pela cdk resultando na inativação de sua função reguladora no ciclo celular2.

Outros estudos mostraram que a E7 de HPVs de alto-risco tem a habilidade de romper atividades inibidoras dos inibidores de quinases dependentes de ciclina (CKIs), como a p21 e a p27. A inativação de ambas as proteínas pRb e p21 é necessária para impedir a interrupção do ciclo celular46. A ligação das proteínas p21 e p27 pela E7 interfere na atividade do p53 em induzir a interrupção da fase G1, seguida de danos de DNA (Fig. 2.9). É importante notar que células que expressam a E7 contém níveis elevados de p53 e p21, observação que não é consequência de indução de transcrição, mas sim, estabilização de proteínas47. A presença de proteínas E6 de HPVs de alto-risco atuam na redução de níveis elevados de p53 induzidos pela atividade da E7.

A proteína E7 do HPV-16 pode também induzir duplicação anormal do centrômero48. Embora a E6 provoca também tal efeito, a E7 induz distúrbios mitóticos relacionados aos centrômeros, mecanismo ainda não conhecido. Duplicações anormais do centrômero resultam na instabilidade genômica e aneuploidia (sinal de célula cancerosa). Tal atividade contribui para a progressão da malignidade em HPVs de alto-risco.

O gene E6 como alvo de estratégias moleculares anti-câncer
De acordo com a etiologia viral do HPV e sua relação com a derivação de lesões neoplásicas e displásicas, torna-se fundamental o desenvolvimento de estratégias terapêuticas anti-câncer. Uma possibilidade bem óbvia é o desenvolvimento de vacinas específicas para o HPV que possam ser usadas em programas de imunidade como prevenção de infecções por HPV, assim como tratamento de lesões cancerosas. Outra possibilidade é atingir diretamente proteínas virais específicas que são continuamente expressas e funcionalmente ativas em lesões induzidas pelo vírus36.

Como descrito acima, a E6 e a E7 representam as principais oncoproteínas do HPV e estas são geralmente expressas em células cancerosas positivas para o HPV. Além disso, foi demonstrado que a expressão contínua da região E6/E7 é um dos pré-requisitos para a manutenção do fenótipo “transformado” das linhagens celulares derivadas de carcinomas cervicais.

Neste cenário, onde a E7 age concomitantemente como uma proteína pró-proliferativa e pró-apoptótica e, a E6 que age como uma proteína anti-apoptótica, a E6 é um alvo ideal para terapia molecular. A idéia pode ser corroborada pelo fato de que em células derivadas de câncer cervical, a degradação do p53 é totalmente dependente da presença da oncoproteína viral E6, mesmo após décadas sob crescimento em cultura de células, indicando que a presença contínua da E6 é que mantém o fenótipo “transformador”. Na verdade, um estudo recente mostrou que a expressão de peptídeos dos quais especificamente interagem com a E6 derivada do HPV-16, freqüentemente, encontrados em carcinoma cervical, resultam tanto na acumulação do p53 como na indução de apoptose em células positivas para o HPV-16, mas não em células negativas para tal vírus49. Portanto, a era de estratégias moleculares da qual estamos atualmente vivendo, é a chave do desenvolvimento de novas terapias para lesões virais associadas ao HPV.

Sumário
Infecções de HPV são importantes para a patogênese da neoplasia cervical. Os mecanismos pelos quais a infecção do HPV, em um número pequeno de casos, resulta em malignidade. Três proteínas codificadas por HPVs genitais de alto-risco, a E6, a E7 e em menor extensão a E5, influenciam fatores que controlam o ciclo celular e a proliferação. Tais interações resultam na interrupção do controle do ciclo celular. As funções das proteínas E6, E7 e E5 são as mais relevantes para a formação de malignidade em células HPV-transformadas. Este capítulo foi baseado nas revisões de Howley e Lowy2 e Fehrmann e Laimins3.

ABREVIAÇÕES
BPV- papilomavirus bovino
cdk- quinase dependente de ciclina
E- precoce (early)
G- gap
HFK- queratinócitos humanos primários
HPV- papilomavirus humano
kD- kilodalton
L- tardio (late)
M- mitose
ORF- esquadro de leitura (open reading frame)
p53- proteína de 53kD
P97- promotor posicionado no nucleotídeo 97
S- síntese de DNA
LCR- região controladora longa
URR- região reguladora upstream
EGF- fator de crescimento epitelial
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