Métodos diagnósticos baseados em Biologia Molecular

Laura Sichero
Enrique Boccardo
Luisa Lina Villa

Introdução

Atualmente, a captura de híbridos de segunda geração (Hybrid Capture ou HC2) e uma variedade de protocolos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR ou polymerase chain reaction) utilizando iniciadores consenso e degenerados são os métodos mais utilizados para a detecção de DNA de papilomavírus humano (HPV) em ensaios clínicos e estudos epidemiológicos. Este capítulo descreve as tecnologias disponíveis para a detecção de HPV, discute os novos métodos que estão em desenvolvimento, e sua aplicação potencial para triagem em grande escala. Idealmente, um teste para HPV deve permitir a detecção de vários tipos virais, identificar os tipos individuais, além de fornecer informação quantitativa da carga viral de cada tipo encontrado. Adicionalmente, deve ser de fácil realização, altamente reprodutível, ter alta especificidade e sensibilidade, e ser passível de automatização. Uma vez que o verdadeiro valor da carga viral e a relevância biológica dos diferentes tipos de HPV ainda não são completamente conhecidos, qualquer teste para HPV deveria ser capaz de detectar os tipos de alto risco clinicamente relevantes com uma sensibilidade de pelo menos 10.000 cópias do genoma por espécime. Para tanto, torna-se necessário dispor de amostras a serem utilizadas como referência, além de reagentes confiáveis e protocolos padronizados para a validação dos testes.

O diagnóstico morfológico das infecções por HPV é amplamente utilizado tanto em esfregaços celulares quanto em cortes de tecido. A presença inequívoca de coilócitos ou disqueratócitos indica uma infecção produtiva por estes vírus. Entretanto, com o desenvolvimento de técnicas de detecção do DNA viral tornou-se evidente a baixa sensibilidade do diagnóstico morfológico, que geralmente resulta em um grande número de resultados falso-positivos [1].

As partículas virais intactas, de aproximadamente 50 nanômetros de diâmetro, são encontradas quase que exclusivamente em lesões benignas, onde estão distribuídas de forma regular dentro do núcleo das células infectadas. Desta maneira, pode-se determinar a presença dos papilomavírus pelo emprego de técnicas de imunohistoquímica que utilizem anticorpos policlonais contra as proteínas do capsídio viral. Por outro lado, a expressão destas proteínas virais não ocorre em lesões precursoras ou malignas, o que pode resultar na emissão de laudos falso-negativos.

Pelo exposto, torna-se evidente a necessidade do emprego de outras técnicas para a detecção da infecção por HPV, sendo a mais amplamente empregada, hoje, a de detecção do material genético do vírus nas amostras biológicas. Além disso, nenhum método de diagnóstico de HPV baseado exclusivamente em aspectos morfológicos permite a determinação do tipo viral presente no espécime, o que é fundamental para a determinação do risco de desenvolvimento de doença da cérvice uterina.

Detecção molecular dos papilomavírus

Os métodos utilizados para a detecção do material genético de HPV são essencialmente de dois tipos: baseados em hibridização direta do DNA ou RNA viral presente nos espécimes, ou baseados na amplificação in vitro destes genomas, seguida de sua identificação tipo-específica, freqüentemente por hibridização ou mapeamento por digestão do DNA viral por enzimas de restrição (Tabela 6.1..1). A hibridização consiste na formação de fitas duplas (híbridos) entre fitas de DNA ou RNA [2], que ocorre devido a complementaridade das seqüências de nucleotídios. A estabilidade do híbrido formado pode ser modulada não só pela natureza e comprimento das seqüências, mas também pela temperatura da reação e concentração salina da solução de hibridização [3]. Estes parâmetros, entre outros, definem o rigor (estringência) da reação, fator determinante da especificidade e sensibilidade dos ensaios. Em geral, as técnicas utilizadas para a detecção de DNA de HPV empregam princípios de hibridização molecular DNA/DNA ou RNA/DNA, envolvendo de um lado o DNA ou RNA extraído do espécime clínico e, do outro, o DNA dos diferentes tipos de HPV clonados.

O único método que permite a localização dos genomas virais em relação à topografia do tecido é a hibridização in situ [4]. Esta metodologia permite a localização do DNA ou RNA viral de forma específica em células definidas ou mesmo em cromossomos isolados. Uma vez que pode ser realizada em tecidos fixados, embebidos em parafina, é principalmente empregada em estudos retrospectivos. Cortes de tecido fresco ou fixado, ou mesmo esfregaços celulares, são submetidos à hibridização in situ em lâminas de vidro. Ao tecido previamente tratado com proteases, é adicionada uma mistura de hibridização contendo uma sonda, radioativa ou não. A sonda pode ser um fragmento de DNA, RNA ou oligonucleotídios sintéticos. Após a hibridização, segue-se a lavagem para a remoção dos híbridos inespecíficos e do excesso de sonda, sendo em seguida o sinal revelado por auto-radiografia, no caso de sondas radioativas, ou por reação colorimétrica, no caso de sondas quimicamente modificadas. A técnica de hibridização in situ é laboriosa e de relativa baixa sensibilidade. A realização desta técnica em combinação com a PCR oferece uma solução para este problema [5]; entretanto, a PCR-in situ não é um método amplamente utilizado.

No passado, a hibridização do tipo Southern blot foi amplamente utilizada para a detecção de DNA de HPV. Este método é empregado para a análise de seqüências de DNA aderidas a filtros ou membranas de nitrocelulose ou derivados [2]. Em resumo, o DNA extraído de células ou tecidos é digerido por enzimas de restrição e posteriormente submetido a eletroforese em gel para separação dos fragmentos gerados. Após a desnaturação do DNA por solução alcalina, e transferência para os filtros em condições que garantem a adesão das fitas simples de DNA em posições definidas, segue-se a hibridização com a sonda molecular. A principal desvantagem deste método é a necessidade do isolamento prévio de quantidades relativamente grandes e de alta pureza do material genético dos espécimes biológicos, não sendo aplicável ao estudo de tecidos fixados.

Há alguns anos, tornou-se disponível uma metodologia que emprega a hibridização em solução, conhecida por captura de híbridos (Hybrid Capture, Digene Corporation). A sensibilidade analítica desta técnica é alta, sendo capaz de detectar 18 tipos diferentes de HPV presentes no espécime [6]. Este ensaio está comercialmente disponível e vem sendo empregado em diversos estudos epidemiológicos.

Os métodos baseados em PCR [7] são comumente empregados para a detecção de DNA de HPV. Esta reação utiliza uma DNA polimerase, enzima responsável pela replicação do DNA, além de uma molécula de DNA simples fita como molde para a síntese de uma nova fita complementar, e de pequenos segmentos de DNA também simples fita conhecidos como iniciadores. A replicação do DNA in vitro inicia-se com a desnaturação do DNA molde, ou seja, a separação da dupla fita, o que pode ser obtido por aquecimento. Segue-se o pareamento dos iniciadores com o DNA molde, para que a partir destes pequenos segmentos de DNA dupla fita recém-formados se processe a formação da nova molécula de DNA. Assim, na reação de PCR direciona-se a DNA polimerase para que ela sintetize uma região específica do DNA molde de interesse. A reação é repetida de forma cíclica, geralmente de 25 a 40 vezes. O produto final consiste, então, de cópias fiéis da região específica do DNA molde que foi flanqueada pelos iniciadores. Uma vez que o DNA é uma molécula bastante estável, diversas fontes podem servir como DNA molde. Por exemplo, séries históricas de serviços de Patologia, ou o DNA extraído de tecidos obtidos de amostras com até milhares de anos, são passíveis de amplificação. A técnica de PCR fornece medidas precisas de exposição ao HPV e permitiu que os estudos epidemiológicos mais recentes comprovassem que a infecção por este vírus é um determinante intermediário e fundamental da seqüência de eventos que leva ao carcinoma do colo uterino. Os métodos baseados em PCR têm a maior sensibilidade de detecção dos genomas virais e acoplados a um ensaio de hibridização permitem a detecção de todos os tipos de HPV, em torno de 30 no caso de espécimes provenientes da mucosa genital. Ainda mais, A PCR requer quantidades muito pequenas de DNA da amostra biológica podendo se utilizadas preparações relativamente impuras. Por ser um método muito sensível, é necessário controlar muito bem as condições do ensaio a fim de eliminar os resultados falso-positivos devidos à contaminação. Atualmente são utilizados conjuntos de iniciadores consenso ou genéricos que permitem a amplificação de um grande número de tipos de HPV em uma única reação [8-11].

A análise dos dados gerados em diversos estudos que basearam a identificação de HPV na PCR apóia a sua aplicação no diagnóstico clínico. A utilização deste ensaio específico e sensível em amostras biológicas é capaz de elucidar as dúvidas originadas do diagnóstico citológico, como nos casos de esfregaços cervicais de pacientes mais idosas onde erros de classificação podem ocorrer devido às alterações celulares provocadas pelas mudanças hormonais. Desta maneira, o diagnóstico de HPV por PCR vem sendo considerado como um possível complemento importante aos diagnósticos cito-histopatológicos e colposcópicos, não apenas de lesões pré-neoplásicas, mas também das infecções subclínicas tanto na mulher quanto no homem. Entretanto, antes que isso possa ser considerado na rotina da prática clínica, os testes deverão preencher aos seguintes princípios: ter elevada sensibilidade e especificidade para detectar um amplo espectro de tipos virais genitais; ser realizável em espécimes colhidos de modo não invasivo como esfregaços celulares ou lavados vaginais; ser altamente reprodutível a nível intra- e entre laboratórios; ser passível de execução e leitura automática; ser realizável em grande escala; e ter uma boa relação custo-benefício em programas de rastreamento.

Captura de híbridos.

O ensaio HC2 está baseado na hibridização, em solução, de longas sondas sintéticas de RNA complementares às seqüências genômicas de 13 tipos de HPV de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68) e 5 tipos de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44). Estas sondas são utilizadas na preparação das misturas A e B, para alto e baixo risco respectivamente, utilizadas em duas reações separadas [6]. O DNA presente na amostra é hibridizado em solução com cada uma das misturas de sondas permitindo a formação de híbridos específicos DNA de HPV/RNA da sonda. Estes híbridos são, em seguida, reconhecidos por anticorpos adsorvidos aos poços de uma placa de microtitulação, e que são capazes de reconhecer especificamente híbridos de RNA-DNA. Os híbridos de DNA-RNA imobilizados são detectados mediante uma série de reações que liberam luz e pode ser detectada em um aparelho denominado luminômetro. A intensidade da luz emitida, expressa como unidades relativas de luz, é proporcional à quantidade de DNA alvo presente na amostra e fornece uma medida semi-quantitativa da carga viral. Atualmente, a HC2 encontra-se disponível no formato de placa de 96 poços, sendo de fácil realização para a aplicação clínica além de compatível com a automatização. Uma vez que o ensaio de HC2 não depende da amplificação do DNA alvo, o ensaio não precisa ser realizado em áreas especiais a fim de evitar a contaminação. Além disso, freqüentemente apenas a mistura para os 13 tipos de alto risco é utilizada para a triagem do carcinoma da cérvice uterina, uma vez que são os tipos mais prevalentes associados ao carcinoma da cérvice uterina no mundo todo. Estudos recentes detectaram a presença dos tipos 66, 73 e MM4 (um novo tipo associado ao HPV-82) em carcinomas escamosos da cérvice uterina que poderiam ser incluídos nas misturas de sonda. A adaptação da série de alto risco à prevalência geográfica dos diferentes tipos de HPV poderia aumentar a especificidade do teste. A utilização desta série de sondas limitada apenas aos tipos de HPV de alto risco geograficamente mais prevalentes poderia representar uma solução para países em desenvolvimento sem programas de rastreamento de câncer de colo uterino apropriados. Todavia, vários estudos têm mostrado que a mistura de HC2 para alto risco apresenta reação cruzada com tipos de HPV não presentes na mesma [12]. Foi observado que a técnica de HC2 utilizando a mistura de sondas de alto risco com um limite para positivos de 1.0 pg/ml, era capaz de detectar os tipos de HPV 53, 66, 67, 73 e outros tipos não definidos. Ainda mais, estes autores observaram que o aumento do limite para positivos de 10.0 pg/ml não eliminava a reação cruzada com os tipos 53 e 67. A reação cruzada da mistura de sondas de alto risco da HC2 com tipos de HPV que podem apresentar um risco significativo para o câncer da cérvice uterina pode ser considera benéfico. Por outro lado, a reação cruzada com tipos de baixo risco origina resultados falso-positivos, podendo diminuir a especificidade do teste [13].

O ensaio de captura de híbridos de terceira geração (HC3, Digene Corporation) que foi recentemente desenvolvido, utiliza sondas de RNA assim como na HC2, entretanto em combinação com oligonucleotídios de captura biotinilados que são complementares a seqüências únicas dentro da região alvo. Estes oligonucleotídios são apenas utilizados objetivando-se a captura da seqüência alvo desejada em poços de placas cobertos com estreptavidina. Os sinais são gerados por sondas de RNA que hibridizam à regiões da seqüência capturada diferentes daquelas dos oligonucleotídios de captura de DNA biotinilados. Ainda mais, o ensaio também foi desenvolvido com o intuito de reduzir a hibridização não-específica, uma vez que utiliza oligonucleotídios bloqueadores (moléculas de DNA não-marcadas que são complementares aos oligonucleotídios de captura biotinilados) a fim de eliminar a reatividade cruzada, porém mantendo a especificidade. Utilizando-se esta metodologia também será possível testar variantes moleculares de alguns tipos virais uma vez que até alvos com apenas uma mudança nucleotídica podem ser especificamente detectados.

Adicionalmente, com o objetivo de testar múltiplas amostras simultaneamente, a Digene Corporation desenvolveu uma plataforma robótica automatizada para a captura de híbridos denominada sistema de captura rápida (Rapid capture system) que permite o manejo de microplacas de 96 poços. Esta estação robótica executa incubação, agitação e lavagens, e permite que um único usuário teste 450 espécimes em oito horas.

Testes baseados em PCR.

O DNA do HPV pode ser amplificado seletivamente por PCR seguida da análise dos produtos amplificados por diferentes técnicas incluindo a eletroforese em gel, a hibridização tipo-específica, ou ainda pode ser acoplado ao seqüenciamento direto do DNA. A sensibilidade e a especificidade dos métodos baseados em PCR pode variar dependendo do conjunto de iniciadores utilizados, do tamanho do produto de PCR, das condições da reação, da eficiência da polimerase de DNA empregada, e da habilidade para a detecção de vários tipos virais. Em teoria, uma reação de PCR pode produzir um milhão de cópias a partir de uma única molécula de DNA dupla fita após 30 ciclos de amplificação. Devido a sua versatilidade e altíssima sensibilidade, vários sistemas baseados em PCR encontram-se disponíveis.

Os protocolos mais amplamente utilizados empregam iniciadores consenso e degenerados complementares a uma região altamente conservada do gene L1, e que são potencialmente capazes de discriminar todos os tipos de HPV que infectam as mucosas. Entre estes, estão o par único de iniciadores consenso GP5/6 e sua versão extendida GP5+/6+ [8], e os iniciadores degenerados MY09/11 [11] e sua versão modificada PGMY09/11 [9]. Após a hibridização com sondas tipo-específicas cerca de 40 tipos de HPV podem ser identificados com precisão. A hibridização pode ser realizada em diferentes formatos, incluindo a hibridização em linhas (reverse line-blot hybridization) e em placas de microtitulação, que são compatíveis com automatização.

Os iniciadores PGMY09/11 foram desenvolvidos com o objetivo de elucidar algumas limitações no tradicional sistema de iniciadores degenerados MY09/11. A sensibilidade demonstrada com este novo sistema de iniciadores é de 10 genomas de HPV por reação de PCR para todos os genótipos presentes no espécime. Este sistema é composto de dois conjuntos de iniciadores de oligonucleotídios não-degenerados e desenhados para amplificar os mesmos 450 pb da região do gene L1 amplificados pelos iniciadores MY09/11 originais. Os iniciadores PGMY09/11 foram desenhados após o alinhamento de seqüências de todos os tipos de HPV genitais conhecidos, minimizando qualquer possível desparamento, além de simultaneamente minimizando o número de oligonucleotídios em cada conjunto. O conjunto de iniciadores PGMY11 é composto de 5 oligonucleotídios, enquanto o conjunto PGMY09 contêm 13. Esta técnica foi avaliada utilizando-se o ensaio de hibridização reversa em linhas [9] que inclue sondas para 27 diferentes genótipos de HPV (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68, MM4 [novos tipos de HPV: MM4 relacionado a HPV-82; MM7 relacionado a HPV-83; MM8 a HPV-84, MM9 a HPV-73], MM7, MM9 e 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, MM8) além de duas linhas contendo o controle da beta-globina humana. Este sistema de hibridização está sendo expandido atualmente para incluir 12 tipos de HPV genitais adicionais (61, 62, 64, 67, 69, 70, 71, 72, CP6108 [novos tipos de HPV:CP6108 relacionado a HPV-91; CP8304 relacionado a HPV-62; IS39 relacionado a HPV-82] CP8304, IS39. Em resumo, o ensaio de hibridização reversa em linhas está baseado na hibridização do produto amplificado a sondas específicas de DNA que estão imobilizadas na nitrocelulose ou em tiras de nylon. A fim de poder ser capaz de discriminar os tipos, as sondas tipo-específicas de HPV são ligadas as tiras em linhas paralelas individuais em posições definidas e, desta maneira, o produto amplificado é hibridizado a uma posição particular, identificando o tipo de vírus infectante. Para a detecção da hibridização, a reação de amplificação deve ser realizada com iniciadores que possuem uma molécula de biotina aderida, e que se torna incorporada ao produto amplificado. Uma vez que ocorre a hibridização, a presença do produto amplificado é detectada utilizando-se um conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina; enquanto a estraptavidina se liga a biotina incorporada ao produto amplificado, a fosfatase alcalina é imobilizada na região específica em que ocorre a hibridização. Esta enzima catalisa a formação de um produto colorido após a adição de seu substrato e uma linha colorida se desenvolve no local em que o produto amplificado hibridizou com a sonda específica. A medida da posição da linha colorida em relação a uma linha já estabelecida permite que o tipo viral seja identificado.

Em uma comparação preliminar de PGMY09/11 com o sistema de iniciadores MY09/11, houve concordância de 91,5%; entretanto, o sistema PGMY foi significativamente capaz de detectar mais amostras HPV positivas. Entre 247 amostras examinadas, houve uma prevalência de HPV de 62,8% utilizando-se os iniciadores PGMY09/11 comparada a uma prevalência de 55,1% com os iniciadores MY09/11. Foi observado também com o uso dos iniciadores PGMY09/11 um grande aumento na detecção de infecções múltiplas, e também na amplificação de tipos de HPV que são ineficientemente detectados utilizando-se os iniciadores MY09/11 [3].

Um outro sistema muito utilizado baseia-se nos iniciadores consenso GP5+/6+. Embora o produto amplificado por GP5+/6+ seja relativamente pequeno (150 pb), a variação da seqüência nucleotídica deste fragmento é grande o suficiente para a discriminação dos tipos de HPV após o seqüenciamento ou hibridização [8]. Recentemente, um sistema de hibridização reversa em linhas para o sistema GP5+/GP6+ capaz de discriminar 37 tipos de HPV mucosotrópicos foi desenvolvido, sendo um teste de alto rendimento tanto em estudos epidemiológicos quanto em pesquisa clínica [14-15].

Outro par de iniciadores consenso capaz de amplificar um fragmento menor (65 pb) do gene L1 encontra-se disponível, o que potencialmente permitiria um aumento na sensibilidade do ensaio. Este método conhecido como SPF-PCR (short PRC fragment-polymerase chain reaction) [10] também permite a discriminação de tipos de HPV através da hibridização reversa em linhas. Entretanto, devido ao pequeno tamanho do fragmento amplificado pode-se antecipar uma reduzida capacidade de discriminação de tipos quando comparado aos outros métodos descritos. No entanto, os autores descreveram a discriminação de 43 tipos diferentes de HPV utilizando-se esta metodologia.

Novas tecnologias.

O ensaio conhecido como Amplicor MWP e desenvolvido pela Roche Molecular Diagnostics, está baseado em um conjunto de iniciadores não-degenerados objetivando a amplificação de um pequeno fragmento de 170 pb do gene L1 de 13 genótipos de alto-risco. O produto amplificado é imobilizado a um conjunto de moléculas de captura adsorvidas a poços de uma placa de 96 poços (MWP ou microtiter well plate) e visualizado por detecção colorimétrica utilizando-se um sistema desenvolvido pela Roche Amplicor chemistry. Ainda mais, este teste foi desenvolvido utilizando-se a TaqGold DNA polimerase, que minimiza a quantidade de amplificação não-específica, aumentando, assim, a sensibilidade do teste. Entretanto, uma vez que estes iniciadores foram desenhados para discriminar apenas tipos de HPV de alto risco, este teste não é verdadeiramente genérico.

A Biomedlab Company (Seoul, Korea) desenvolveu um sistema de detecção de HPV baseado em microarray (chips de DNA) que atualmente permite a detecção de 22 tipos por imobilizar sondas de oligonucleotídios HPV tipo-específicas e um controle (sonda de beta-globina humana) em uma lâmina de vidro. Em resumo, o DNA alvo é submetido a uma PCR padrão na presença de oligonucleotídios fluorescentes (marcados com os fluorocromos Cy5 ou Cy3) empregando iniciadores para ambos genes da beta-globina (PC03/04) e para a região de L1 (iniciadores GP5/6 modificados) de diversos tipos de HPV. Os produtos de PCR marcados são, então, hibridizados à lâmina, que é posteriormente rastreada por fluorescência de laser. Nos casos de infecção por mais de um tipo de HPV, múltiplos sinais de hibridização podem ser observados. A utilidade e praticidade deste método ainda precisa ser demonstrada, embora dados preliminares indicaram alta sensibilidade. Todavia, seu presente formato requer o uso de equipamentos caros para a detecção do sinal.

Em resumo, é necessário avaliar as vantagens e desvantagens de cada método de detecção da infecção por HPV, além de definir claramente os objetivos da investigação, antes da escolha do método diagnóstico a ser utilizado.

Desempenho e reprodutibilidade dos ensaios.

Vários estudos têm comparado o desempenho dos ensaios disponíveis. A triagem de grandes séries de amostras no mundo todo utilizando o ensaio HC2 tem mostrado que existe uma concordância excelente de sensibilidade e especificidade, reforçando a importância da disponibilidade de um ensaio comercial de qualidade controlada. Testes baseados em PCR, como os que utilizam MY09/11 e GP5+/6+, também têm mostrado boa concordância. Demonstrou-se maior eficiência de detecção de DNA de HPV com os iniciadores MY09/11 em relação aos iniciadores GP5+/6+ usando-se como alvo DNA extraído de material fresco [16]. Porém, observou-se que na amplificação de DNA de HPV extraído de material parafinado, a taxa de detecção é maior utilizando-se os iniciadores GP5+/6+, em relação a MY09/11, já que o fragmento amplificado por estes iniciadores é menor. No entanto, vários fatores como por exemplo as técnicas de extração do DNA, os procedimentos de obtenção, armazenamento e transporte das amostras, e o uso de diferentes polimerases, são capazes de afetar as reações de PCR e, conseqüentemente o desempenho do teste. Desta maneira, torna-se necessário o desenvolvimento e o uso comum de protocolos, reagentes e amostras de referência validados. Recentemente, a Organização Mundial da Saúde lançou um estudo colaborativo com o objetivo de fornecer uma ferramenta de padronização dos ensaios para a detecção de DNA de HPV tanto para o uso em estudos epidemiológicos quanto para ensaios da eficácia de vacinas em diferentes partes do mundo. O objetivo deste estudo é preparar e caracterizar um painel de amostras de DNA de HPV de referência que permitirá que diferentes laboratórios possam comparar a sensibilidade e a especificidade dos ensaios em uso. Estes resultados ainda não estão disponíveis.

Amostras com infecção por múltiplos tipos de HPV.

O estudo do papel das infecções por múltiplos tipos de HPV no desenvolvimento de lesões de alto grau ou do carcinoma da cérvice uterina tem sido atrasado devido ao fato que o teste para DNA de HPV mais utilizado, a HC2, não discrimina entre diferentes tipos no caso de uma infecção múltipla. Ainda mais, os diferentes métodos baseados em PCR não são igualmente eficientes em detectar este tipo de infecções devido às limitações no espectro de tipos de HPV detectáveis em cada ensaio e no desempenho dos mesmos [17]. Por exemplo, tem sido observado que o sistema GP5+/6+ detecta somente 47% das amostras com múltiplos tipos de HPV quando comparado aos 90% detectado pelo sistema MY09/11 [18].

Em geral, os sistemas baseados em PCR e que utilizam vários iniciadores, como os PGMY09/11 e SPF-PCR, são mais efetivos na detecção de infecções múltiplas que os sistemas que utilizam iniciadores consenso como GP5+/6+. Isto pode ser particularmente observados em casos de infecções onde um tipo de HPV encontra-se em grandes quantidades, uma vez que a cinética da reação de PCR utilizando pares de iniciadores simples é desfavorável para os tipos presentes em quantidades menores. Uma vez que foram desenvolvidas ferramentas mais precisas para a identificação de infecções múltiplas, como por exemplo, a hibridização reversa em linhas, seria de interesse determinar se a sua presença é um marcador útil para o estabelecimento da infecção persistente e o desenvolvimento de lesão ou progressão. Todavia, foi sugerido que a persistência da infecção por HPV é independente da co-infecção com outros tipos [19].

Determinação da carga viral.

A existência de uma associação entre o alto número de cópias virais e o risco de desenvolvimento de lesões cervicais associadas a infecção por HPV foi sugerida em alguns estudos [20]. A princípio, os métodos existentes para abordar a questão da quantificação viral eram muito trabalhosos e requeriam uma grande quantidade de DNA, como o Southern blot, ou eram pouco precisos, como é o caso da PCR semi-quantitativa, da hibridização in situ, e da HC2. A estimativa da carga viral depende diretamente do número de células utilizadas e, conseqüentemente, da quantidade de DNA testada. Este é um requerimento absoluto que não é levado em consideração nos casos das técnicas de HC2 e de alguns protocolos baseados em PCR. Atualmente, não existe consenso em relação ao melhor método para a quantificação de HPV em amostras biológicas.

No teste de HC2, a carga viral pode ser inferida a partir da quantidade de luz emitida na reação, uma vez que esta é proporcional à quantidade de DNA presente em cada espécime. Entretanto, tem sido discutido que a HC2 somente é capaz de detectar cargas virais altas, e que esta é uma técnica menos sensível em relação aos outros ensaios disponíveis hoje.

A utilidade da técnica de PCR para a quantificação de DNA está baseada no uso de controles na reação a fim de compensar o grande número de fatores que podem afetar o rendimento da mesma, como por exemplo, o número de ciclos, a presença de inibidores, as condições da reação, a formação de dímeros de iniciadores, a limitação dos reagentes nos últimos ciclos, entre outros. Todas as abordagens para quantificação envolvendo a técnica de PCR requerem o uso de um controle interno, que pode ser um fragmento de DNA modificado a partir do alvo e amplificado pelos mesmos iniciadores competitivamente. Alternativamente, este fragmento pode ser construído de modo a compartilhar com o alvo somente o sítio de ligação aos iniciadores. O ideal é que o competidor seja o mais semelhante possível à seqüência de interesse. Entretanto, se forem muito parecidos pode ocorrer a formação de heteroduplexes entre as seqüências complementares dos dois produtos, e a relação entre o DNA alvo e o competidor pode ser comprometida.

Na PCR quantitativa competitiva quantidades crescentes e conhecidas de competidor são adicionadas à mesma quantidade do espécime a ser testado. Desta forma, mudanças na eficiência da amplificação afetarão igualmente o competidor e o alvo. A quantificação dos produtos pode ser feita por densitometria após eletroforese ou medida pela incorporação de nucleotídios radioativos. Ainda mais, a estimativa do número de cópias pode ser calculada a partir da comparação com uma curva construída paralelamente a partir de concentrações de DNA de HPV conhecidas.

Outra alternativa é o uso de um conjunto adicional de iniciadores específicos para um gene de expressão estável como a actina. Entretanto, podem existir diferenças nas eficiências de amplificação e, conseqüentemente, na concentração final dos produtos amplificados, o que torna essa estratégia não totalmente confiável [21].

Apesar de ser muito trabalhoso, o método de PCR de baixa estringência (LS-PCR ou low-stringency PCR) utilizando iniciadores consenso tem sido utilizado em estudos epidemiológicos [22]. Esta técnica se baseia no uso de iniciadores específicos sob condições de baixa estringência. O resultado é a amplificação da seqüência específica de DNA definida pelos iniciadores, além de um conjunto de produtos de baixa estringência resultado de interações não específicas dos iniciadores com outras seqüências presentes na amostra. Neste caso, há uma relação inversa entre as intensidades relativas do produto específico e dos fragmentos de baixa estringência. A carga viral é inferida pela razão entre os dois fragmentos gerados. Ao contrário da PCR competitiva, o competidor não precisa ser adicionado à reação, uma vez que este é uma seqüência de DNA humano já presente nas amostras biológicas que age como um controle interno. A principal vantagem da ausência de variação da técnica em função da mudança da quantidade de DNA sendo amplificada é que a concentração de DNA das amostras biológicas a serem quantificadas não precisa ser conhecida, o que facilita o trabalho laboratorial.

Um método mais preciso e controlado apenas recentemente disponível, é a PCR em tempo real [23]. Uma desvantagem desta técnica é que exige o uso de equipamentos e reagentes de custo elevado. Todavia, sua aplicabilidade em estudos epidemiológicos é importante em função da quantidade de informação gerada. Nesta metodologia, uma sonda que consiste de um oligonucleotídio que contem na extremidade 5´ uma molécula fluorescente (reporter) e na extremidade 3´ uma molécula bloqueadora (quencher) é adicionada aos tubos de PCR. Se não ocorre amplificação do DNA, a sonda está intacta, e a proximidade do reporter ao quencher reduz a fluorescência emitida pelo repórter. Por outro lado, durante a fase de extensão da PCR, a sonda irá parear-se com o DNA alvo entre os sítios dos iniciadores e é, então, clivada pela atividade 5´ nucleásica da Taq DNA polimerase, conforme o iniciador vai sendo estendido. A clivagem da sonda leva à separação entre o repórter e o quencher, resultando na emissão do sinal. A cada ciclo, moléculas adicionais de repórter vão sendo clivadas, levando ao aumento de fluorescência. A emissão de fluorescência a cada ciclo da amplificação é diretamente proporcional à quantidade de produto amplificado gerado e, portanto, é considerado um método adequado para a estimativa da carga viral. Além disso, este sistema quantitativo tem sido utilizado para determinar a carga viral de HPV controlando o conteúdo de DNA celular na amostra através da quantificação do gene da beta-actina humana. Mais recentemente, foram desenvolvidos protocolos que utilizam um formato múltiplex, incluindo sondas complementares a mais de um tipo de HPV. Adicionalmente, alguns pesquisadores adaptaram o sistema citado para a utilização de iniciadores degenerados como MY09/11 e genéricos como GP5+/6+ [24]. A aplicabilidade clínica dos métodos baseados em PCR em tempo real ainda precisa ser comprovada. Lamentavelmente, a verdadeira relevância clínica da determinação da carga viral pode continuar a ser afetada por erros na coleta das amostras cervicais. Mesmo utilizando-se um controle com número de células conhecidos, o tamanho da lesão e a proporção de células infectadas/células normais é muito difícil de controlar.

Espécimes biológicos: coleta, armazenamento e processamento.

A quantidade de amostra, a qualidade e as condições de armazenamento, assim como os procedimentos para a preparação de DNA podem afetar a performance dos diferentes ensaios para a detecção de HPV. Geralmente, os testes não baseados em PCR, como a HC2, são menos afetados por muitas destas variáveis, enquanto que os procedimentos baseados em PCR toleram menos as impurezas devido a sua natureza enzimática. Desta maneira, é fundamental o uso de artifícios para a coleta de grande quantidade de amostras, e meios de armazenamento/transporte que não apenas preservam a morfologia das células, mas também estabilizam o DNA e o RNA.

Artifícios de coleta. Embora estejam disponíveis uma grande quantidade de instrumentos de coleta de esfregaços cervicais, deve ser dada preferência a instrumentos capazes de coletar material da ecto e da endocérvice ao mesmo tempo. Deve também resultar na coleta de um grande número de células que não sejam retidas no instrumento, como no caso de coletores que contêm algodão.
Tampões e outros meios de transporte. Há um grande interesse no desenvolvimento de meios de coleta capazes de preservar as células e macromoléculas incluindo o DNA, o RNA, e as proteínas. O principal objetivo é a realização de análise morfológica e testes moleculares a partir da mesma amostra. Várias soluções de coleta baseadas em metanol estão disponíveis nos kits das novas modalidades de citologia líquida, com a vantagem de que o fluído residual após processamento em monocamada para diagnóstico citológico é suficiente para a realização de vários testes moleculares envolvendo DNA, RNA, ou análise imunohistoquímica de proteínas nas células residuais. De fato, em alguns laboratórios, testes de DNA a partir de espécimes cervicais de citologia líquida já estão em uso.

Foi demonstrado que espécimes citológicos cervicais obtidos de fluido de coleta baseado em fixação por metanol ThinPrep PapTest (AmeriPath) preservam o conteúdo celular que pode ser usado após a coleta para a análise molecular detalhada do DNA [25].

O novo meio Universal collection médium (UCM) da Digene Corporation é um meio capaz de preservar o DNA, o RNA, e as proteínas, assim como a morfologia das células. É formulado para ser compatível aos testes moleculares sem ou com mínimo processamento. Dados preliminares indicam que este meio é capaz de preservar o RNA por muitas semanas a temperatura ambiente, entretanto estudos adicionais são necessários para demonstrar a sua utilidade.

A Ambion possui um produto denominado RNAlater Tissue Collection, que consiste de uma solução estabilizadora de RNA, aquosa, não tóxica, e que estabiliza e protege o RNA intacto em tecidos descongelados e amostras celulares. Células e tecidos podem ser coletadas em RNAlater e armazenadas a temperatura ambiente por até uma semana, a 4 C por até um mês, ou a -20 C indefinidamente.

Espécimes de arquivo. Espécimes de arquivo, incluindo as amostras fixadas e os tecidos emblocados em parafina, constituem uma fonte importante de material para estudos epidemiológicos restropectivos. Entretanto, sabe-se que o tempo de fixação e o tipo de fixador utilizados podem afetar consideravelmente a qualidade dos ácidos nucléicos extraídos. Entre os danos mais comuns estão a degradação do DNA e do RNA, a formação de ligações cruzadas com proteínas, o que diretamente ira interferir com qualquer reação enzimática ou hibridização. Adicionalmente, o método de recuperação do DNA de uma amostra é uma determinante importante para uma amplificação de DNA de HPV bem sucedida. A microdissecção a laser de células alvo de amostras de arquivo e tecidos é hoje amplamente utilizada para aumentar a sensibilidade dos testes.

Testes sorológicos para a detecção da infecção por HPV

A detecção da infecção por HPV através de testes sorológicos ainda não é uma prática de rotina na maior parte dos laboratórios. Os primeiros ensaios sorológicos desenvolvidos não permitiram a utilização imediata desta técnica devido à baixa sensibilidade e especificidade, além da ausência de reagentes disponíveis para avaliar de maneira crítica a resposta imune aos epítopos superficiais conformacionais do vírion. Ainda mais, os estudos sobre os aspectos imunológicos das infecções por HPV e o desenvolvimento de ensaios imunoenzimáticos para detectar estas infecções estiveram estagnados durante muitos anos, devido a ausência de uma fonte de grandes quantidades de antígenos virais, uma vez que os virions não podem ser propagados em cultura de tecidos. Inicialmente, a aquisição das partículas virais de HPV ocorria através da purificação direta de extratos de verrugas, porém o rendimento desta metodologia era muito baixo.

A freqüência e o título de diversos tipos de anticorpos gerados contra HPV mostram uma grande variabilidade que é dependente do tipo de HPV infectante, do epítopo reconhecido, do tipo de amostra, e da sensibilidade do ensaio. Foi observado que após inoculação experimental, a típica resposta humoral ao longo do tempo ocorre da seguinte maneira: rápida resposta de IgM e IgA, seguida de rápido desaparecimento de IgM, manutenção ou pequeno declínio de IgA, e aparecimento de níveis estáveis de IgG. Entretanto, não se sabe ao certo se isso pode ser aplicado a infecção natural.

A abordagem que proporcionou um novo impulso aos estudos de imunologia das infecções por HPV e, em especial, ao desenvolvimento de ensaios sorológicos, foi a produção de partículas semelhantes aos capsídios virais (VLP ou vírus like particles) de HPV-16 [26] (Kirnbauer et al., 1994). Esta produção é efetuada através da transfecção de baculovírus recombinantes com o gene L1 ou com os genes L1 e L2 em células de inseto. A expressão de VLPs também pode ser obtida em bactérias, leveduras, e em outros sistemas de expressão heterólogos. Estes capsídios gerados são semelhantes em conformação aos virions selvagens infecciosos, entretanto não possuem o material genético, potencialmente oncogênico, responsável pelo estabelecimento da infecção viral. Esta propriedade propicia o seu uso como antígeno viral tanto em imunoensaios desenvolvidos a fim de avaliar a resposta humoral contra os virions de HPV em indivíduos sadios e afetados, quanto como antígenos indutores de respostas imunológicas no desenvolvimento de vacinas profiláticas. Assim, a resposta imune humoral contra HPV é geralmente medida por ensaios imunoenzimáticos ligados a enzimas (ELISA ou enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando-se VLPs de HPV tipo-específicas adsorvidas às placas. Este ensaio permite a pesquisa da resposta imune dirigida contra epítopos conformacionais representativos de lesões que apresentam infecções produtivas de partículas virais.

Adicionalmente, foram desenvolvidos ensaios de ELISA que utilizam proteínas ou peptídeos recombinantes de HPV a fim de detectar com alta especificidade anticorpos contra as proteínas precoces E6 e E7. O uso destes peptídeos sintéticos permite avaliar a resposta humoral dirigida a epítopos lineares representativos de lesões portadoras do genoma do HPV já integrado.

As condições dos ensaios podem variar consideravelmente entre os laboratórios e a maior parte dos estudos publicados não fornece informações suficientes sobre a padronização e o controle de qualidade. Ainda mais, a dificuldade em encontrar soros-controle verdadeiramente negativos para a infecção por este vírus e em definir os valores de cutoff para a análise dos resultados dos ensaios imunoenzimáticos permanecem como questões abertas até os dias de hoje, o que impede a comparação direta entre diferentes estudos epidemiológicos. Desta maneira, torna-se importante o compartilhamento de espécimes séricos positivos e negativos através de toda a comunidade de pesquisa, o que poderia auxiliar na obtenção de uma generalização dos resultados gerados.

A sensibilidade do ensaio é medida utilizando-se uma série de amostras de soro obtidas de indivíduos que foram infectados, revelado através do resultado positivo de um teste de detecção de DNA de HPV. Diversos estudos têm demonstrado que o diagnóstico sorológico da infecção por HPV utilizando VLPs de HPV correlaciona bem com a presença de DNA de HPV em esfregaços cervicais [14]. Os anticorpos gerados reconhecem os epítopos conformacionais presentes nas VLPs, e foi observado que a resposta humoral (IgG) contra HPV é estável através do tempo. Estes estudos demonstraram também que o ensaio de ELISA com VLPs de HPV mostram sensibilidade entre 50 e 60%.

A especificidade do ensaio é medida através da comparação dos resultados obtidos utilizando-se amostras de soro de mulheres infectadas pelo mesmo tipo de HPV, mulheres infectadas por tipos diferentes e mulheres não expostas ao vírus. Todos os estudos de sorologia contra VLPs de HPV detectaram forte tipo-especificidade da resposta imune, com a exceção dos tipos de HPV 6 e 11, que tem reação cruzada, e HPV 31, 45 e 16, que mostram baixos níveis de reação cruzada contra HPV 33, 18 e 31, respectivamente. Todavia, o ensaio de ELISA com VLPs de HPV mostram alta especificidade (>90%). Analogamente, foi observado que a resposta sérica de IgA é também HPV tipo-específica, entretanto é menos estável através do tempo que a resposta a IgG. Assim, ensaios de medida da IgA sérica podem ser usados como marcadores de infecção ativa ou recente, ou até como um marcador prognóstico. É importante ressaltar que os níveis de IgG medidos podem estar refletindo não apenas infecções correntes, mas também infecções passadas.

As respostas modestas de anticorpos medidas em diversos estudos podem estar refletindo a ausência de sensibilidade do ensaio ou uma resposta imune deficiente contra HPV, particularmente no caso de séries de câncer em que a integração do genoma de HPV prejudica a expressão de antígenos do capsídio. Ainda mais, uma resposta imune fraca é freqüentemente observada em infecções por HPV uma vez que estes vírus não causam viremia. Como conseqüência, poder-se-ia esperar a classificação inadequada como um problema importante quando se considera a sorologia contra VLPs para a estimativa da prevalência cumulativa da infecção por HPV. Adicionalmente, existem duas variáveis associadas aos resultados obtidos de soropositividade a HPV, e que podem resultar em classificação errônea: a carga viral e a persistência. Uma infecção com alta carga viral deve produzir maior quantidade de proteína que pode efetivamente induzir uma resposta de anticorpos. A infecção persistente foi também demonstrada estar mais associada a soropositividade, uma vez que infecções transientes podem não ser longas o suficiente para evocar uma resposta humoral.

Todavia, associações positivas fortes têm sido descritas para tumores da região anogenital quando comparada à soropositividade de cânceres epiteliais em outras regiões anatômicas, o que é consistente com a evidência da presença de DNA de HPV [27]. Adicionalmente, altos títulos de anticorpo têm sido detectados em mulheres que receberam vacinas de VLPs de HPV.

Mais recentemente, tem sido sugerido que a busca de imunoglobulinas em secreções genitais poderia fornecer um melhor indicador da infecção por HPV, entretanto, a reprodutibilidade e a padronização dos métodos de detecção não foram resolvidos.

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6.2 Diagnóstico do HPV no Homem

Sérgio Mancini Nicolau


Introdução

O papilomavírus humano (HPV) é responsável pela doença sexualmente transmissível mais freqüentemente diagnosticada. São conhecidos mais de 100 tipos diferentes destes vírus e ao redor de 35 deles estão relacionados à infecção anogenital e, está claro, pelas evidências experimentais, clínicas e epidemiológicas, que a infecção genital por HPV é transmitida sexualmente e a relação sexual é necessária para a aquisição do vírus.14 Do mesmo modo, é conhecida e bem definida a relação do HPV com o desenvolvimento do condiloma e com o câncer cervical uterino e suas lesões precursoras.9,70

Também está claro o papel exercido pelo homem na transmissão da infecção genital pelo HPV50,55 e sua importância na história natural do câncer do colo uterino.59

Além disso, tem importância o fato do homem ser, freqüentemente, assintomático, podendo ser responsável pela transmissão para as suas parceiras e pela perpetuação da infecção em uma determinada população.

A maioria dos fatores de risco para a infecção por HPV no homem assemelham-se aos encontrados nas mulheres e, como nelas, o perfil deles na presença dos vírus de alto risco é diferente dos homens que têm vírus de baixo risco oncogênico.64

A epidemiologia da infecção e o comportamento clínico no homem, são ainda pouco conhecidos, mas da mesma maneira que na mulher, a região genital masculina pode albergar o vírus em suas três formas clássicas de apresentação, quais sejam: clínica, subclínica e latente. Na primeira forma, o diagnóstico pode ser feito clinicamente; na subclínica o mesmo só é possível com o auxílio de lentes, seja com o colposcópio ou com o microscópio. Na terceira forma, a latente, o diagnóstico só é factível pela pesquisa do DNA do HPV.

Em virologia, para se caracterizar uma infecção latente e só nestes casos o termo deve ser utilizado, é necessário que se encontre o genoma viral (DNA ou RNA), por técnicas de hibridização ou PCR, em epitélio normal, após cuidadosa análise histológica de material de biópsias. Deve-se ter em mente que, às vezes, esta normalidade é fruto de uma análise incorreta e conseqüente resultado falso-negativo porque a biópsia pode não ter sido realizada na área mais representativa do epitélio.65

Já foi demonstrado que o DNA do HPV está presente na camada basal da epiderme, no núcleo de células infectadas, onde pequeno número de cópias são encontradas.18

Portanto, o encontro do DNA viral em tecido morfologicamente normal,24 pode representar a persistência viral após a regressão das verrugas, período de incubação muito longo que se extende indefinidamente ou até seqüências de DNA viral que foram transmitidas por gerações.18

O HPV, reconhecido como elemento necessário para o desenvolvimento do câncer cervical uterino, parece ser também fator importante na gênese do carcinoma peniano, ao agir de forma sinérgica com outros fatores65 e, embora o DNA do HPV esteja presente no epitélio do pênis e da uretra distal com grande freqüência, o câncer peniano ocorre raramente e somente uma parte das anormalidades visíveis são relacionadas ao vírus, estando o restante relacionado a processos inflamatórios crônicos.21 As lesões pré-cancerosas são observadas à microscopia, mas o risco de evolução para invasão é muito baixo.59

A maior parte das lesões localiza-se na porção interna do prepúcio que é recoberta por pele modificada. Esta região é sede, freqüentemente, de processos inflamatórios, principalmente nos homens não circuncidados ou postectomizados. Menos freqüentemente, encontram-se lesões na parte externa, especialmente na região da pele do pênis (cutis penis), na glande e na bolsa testicular. Também é pouco freqüente o acometimento da uretra por lesão papilomatosa, sendo relatado entre 0,5 e 5% dos casos.46 Na coroa da glande, em especial no adulto jovem e em homens não circuncidados, observam-se formações papilares, normais, distribuídas uniformemente em filas paralelas, que são as chamadas glândulas de Tyson (Fig. 6.2.1).

Fato interessante é que, com certa freqüência, faz-se o diagnóstico da infecção genital por HPV nas mulheres e os parceiros negam episódios anteriores de infecção ou negam a presença de qualquer lesão peniana atual e só procuram o atendimento por causa da infecção em sua parceira.46 Isto levou à realização de vários estudos, principalmente após 1984, utilizando-se o colposcópio na avaliação do parceiro masculino, principalmente quando portador de infecção genital subclínica ou inaparente, com resultados de positividade em 50 a 98% dos casos.4-6,8,12,13,17,31,37,52,54,56,58,69,72

Diagnóstico

Habitualmente, na prática clínica, o diagnóstico tem-se baseado nos achados do exame físico ou da peniscopia, associada às biópsias e, nestas, a observação de coilocitose à histopatologia.33,41,42,46

Mais recentemente, alguns autores introduziram na prática diária, os métodos biomoleculares ou de hibridização molecular, tais como a captura de híbridos e a reação em cadeia de polimerase, que fundamentam-se no encontro do DNA viral. 10,20,25,49

Citologia

O estudo citológico, embora seja de grande valor na avaliação da mulher, no caso da região do prepúcio interno e coroa da glande, raramente leva ao diagnóstico da infecção. O material obtido, apesar de abundante, é composto de células queratinizadas e anucleadas ou com núcleo picnótico.46

Vários estudos demonstraram a presença de alterações citológicas na região uretral compatíveis com a infecção viral, com resultados que variaram entre 4,7 a 49% dos casos, mesmo sem lesão visível.8,15,34,43,46 Mais recentemente, outros autores encontraram alterações celulares sugestivas de infecção por HPV em 81% dos homens que tinham lesões uretrais e em 15% daqueles sem lesões e concluíram que o método, se usado no rastreamento, em função de sua sensibilidade e especificidade, pode levar a um alto índice de falso-positivos.2

Já, no material colhido da região externa do pênis, em parceiros de mulheres com infecção genital por HPV, observou-se coilocitose em 1.6% dos casos.46

A colheita de material para citologia ou pesquisa do DNA viral, da região do prepúcio distal e glande por meio de escovagem, pode causar traumatismo do epitélio e, por isso, levar a resultados falso-positivos à peniscopia.46 Já, para a colheita do material uretral, deve-se utilizar um cotonete embebido em lidocaína a 2%, sem vasoconstritor, o qual permanece na uretra distal por três minutos. Após este tempo, utiliza-se uma outra escova usada para colheita endocervical para obter o material da região, realizando-se quatro a cinco movimentos completos de rotação.46,68 Em estudo realizado na Universidade Federal de São Paulo, observou-se que o material colhido com escova era mais abundante em número de células do que aquele colhido com cotonete, embora ambos se apresentassem com celularidade rica.62

Peniscopia

Vários termos têm sido utilizados para a denominação do procedimento, tais como, colposcopia ou exame colposcópico do pênis,5,17,28,29,34,38,61 porém, esta terminologia deve ser evitada.6,11,17,23 Outros termos como genitoscopia ou androscopia foram empregados,46,52 mas, temos preferência por peniscopia.

A posição de nossa preferência para a realização do exame é com o paciente sentado ou deitado na mesa ginecológica ou em posição de litotomia. A primeira é mais cômoda para o examinador e para o paciente.46 Na posição de litotomia, é possível a avaliação de todo o pênis e bolsa testicular, assim como as regiões perineal e anal.60

O pênis deve ser mantido numa posição tal, que a luz e a visão colposcópica incidam tangencialmente, evitando-se com isto, brilho e reflexo que aparecem quando em visão frontal, em função da umidificação pelo ácido acético e da incidência da luz.

A peniscopia deve ser iniciada pela avaliação de toda a genitália, utilizando-se para isto um colposcópio comum, sem a adição de qualquer substância (Fig. 6.2.2). Deve-se incluir o exame da porção distal da uretra, de preferência com o auxílio de um afastador. O colposcópio deve ter aumentos de quatro, sete e eventualmente treze vezes, na dependência da configuração de suas oculares e objetiva.

A seguir, todo o pênis e bolsa testicular devem ser umidificados com solução de ácido acético a 5%, utilizando-se para isso um borrifador ou “spray”. Faz-se nova umidificação após dois ou três minutos e aguarda-se até completar cinco minutos de contato da solução com a genitália antes de proceder-se à peniscopia (Fig. 6.2.3). Na uretra distal, coloca-se um cotonete embebido na mesma solução, permanecendo no local pelo mesmo período antes de se fazer a avaliação (Fig. 6.2.4).

O passo seguinte é a avaliação da uretra distal com a solução de lugol, utilizando-se para isto um cotonete. A reação, que ocorre na mucosa de aproximadamente 0,5 cm a partir do meato uretral, é imediata. Isto permite a realização de avaliação colposcópica a seguir, à procura de áreas iodo-negativas (Fig. 6.2.5). A observação é fácil necessitando-se apenas afastarem-se as bordas do meato com os dedos ou, com um afastador, avaliar os dois centímetros distais da uretra. Em estudo realizado na Escola Paulista de Medicina, observou-se em cortes histológicos submetidos à coloração de PAS, que nesta região as células têm glicogênio, à semelhançado que ocorre na mulher e, áreas iodo-negativas apresentaram coilocitose em aproximadamente 50% das biópsias realizadas.45

Sabe-se que 99% das lesões uretrais localizam-se junto ao meato e, por isso, não se tem preconizado a uretrocistoscopia para estudo da uretra proximal ou da bexiga.23

Quando não se observam lesões acetobrancas no pênis, faz-se a aplicação de solução de azul de toluidina a 1% sobre toda a genitália, retirando-se o excesso após três minutos com o ácido acético a 1 ou 2% (Fig. 6.2.6).16,30,44,53 Os dois testes se complementam e como a reação com o azul de toluidina é mais duradoura, ele pode funcionar como um marcador.4,46 Deve-se reservar o azul de toluidina apenas para os casos em que não se observam lesões acetobrancas, o que abrevia muito o tempo da peniscopia.

O mecanismo de ação do ácido acético se faz pela vasoconstrição e coagulação temporária de proteínas, o que confere a cor branca em áreas ricas em proteínas. O azul de toluidina é corante vital, básico, tem afinidade e se liga às estruturas ácidas e só impregna células ricas em DNA.44

Para as biópsias das lesões suspeitas, no pênis e na uretra distal, realiza-se bloqueio anestésico local com lidocaína a 2%, sem vasoconstritor e utiliza-se, para tanto, um dermátomo de dois ou três milímetros de diâmetro ou, alternativamente, pinça de biópsia de colo uterino, do tipo Gaylor-Medina, que também pode ser utilizada para biopsiar áreas suspeitas em uretra distal.40

A hemostasia das áreas biopsiadas é feita com ácido metacresolsulfônico concentrado com cotonete (Albocresil®, laboratório BYK) ou com gel de percloreto férrico a 50% (Hemogin), pois o sangramento é muito discreto. A peniscopia em parceiros de mulheres com infecção genital por HPV, com observação de lesões acetobrancas foi descrita, em vários estudos, com cifras que variaram entre 18 e 68% dos casos.7,27,,35,39 Em uma das pesquisas, observou-se concomitância de vários tipos de lesão em 15% dos casos, com predomínio de lesões planas (83%).7

O método tem alto índice de resultados falso-positivos relacionados ao aparecimento de lesões acetobrancas secundárias a processos inflamatórios inespecíficos e infecciosos, bacterianos ou fúngicos, na região interna do prepúcio distal, assim como microtraumas após o coito ou colheita de material citológico desta porção (Fig. 6.2.7)1,19,32,45,51 e raramente têm anormalidades HPV-induzidas à histologia. Nestes casos, os pacientes devem ser tratados durante uma semana com embrocações de água boricada a 3%, várias vezes ao dia, principalmente após as micções, antes de repetir a peniscopia.

Processos inflamatórios das papilas hipertróficas da região da coroa da glande ou ventrais junto ao freio, no prepúcio distal, não estão relacionadas à presença do vírus.22,25

Nicolau, ao realizar peniscopia em parceiros de mulheres com infecção genital por HPV, associada ou não à neoplasia intra-epitelial, não encontrou padrão consistente nas lesões do pênis, induzidas pelo HPV. Somente 23.5% dos resultados histológicos foram sugestivos de infecção viral. Neste estudo, observou-se que o teste de Schiller na uretra distal foi positivo em 45 casos, isto é, observaram-se áreas iodo-negativas. A biópsia destas áreas revelou coilocitose em 20 pacientes (44,44%). O encontro de neoplasia intra-epitelial do pênis (NIP) foi raro (0,94%).47

Histopatologia

O diagnóstico de coilocitose deve ser feito apenas quando houver alterações citoplasmáticas e nucleares evidentes (Fig. 6.2.8), em especial quando existe pleomorfismo nuclear. Strand et al., em estudo de biópsias de pênis, em que compararam o achado de coilocitose e a detecção do DNA do HPV pela técnica de PCR, concluíram que o único sinal que tinha forte relação com a infecção era a alteração neoplásica e que os sinais histopatológicos de HPV, na ausência de neoplasia intra-epitelial, são de valor limitado.63

Hibridização Molecular

Estudos de biologia molecular demonstraram que aproximadamente um terço das lesões penianas têm os tipos 16 ou 33, potencialmente oncogênicos.23 Outros pesquisadores encontraram o DNA viral em esfregaço uretral de pacientes sem lesões clinicamente detectáveis, com o auxílio da peniscopia, em mais de 50% dos casos.73 O escovado desta região, mesmo na ausência de lesão, revelou a presença dos tipos 16, 18 ou 31 em 70% dos casos.72

Diversas pesquisas foram realizadas com o intuito de se definir a metodologia ideal de avaliação biomolecular, assim como o local e a maneira de se realizar a colheita do material.2,3,36,48,66,71

Neste sentido, Nicolau et al., ao analisar parceiros de mulheres que tinham infecção por HPV, comprovada pela captura híbrida, demonstraram que a melhor estratégia para o diagnóstico de infecção por HPV nos homens foi a pesquisa do DNA do HPV, através da colheita de esfregaços de pênis e uretra distal com escova e análise pela mesma técnica. A positividade do DNA viral foi muito superior nos esfregaços quando comparada à obtida nos fragmentos de biópsias realizadas nas mesmas áreas afetadas. Além disso, a adição do material obtido na uretra distal foi importante, pois aumentou significantemente a positividade para DNA-HPV.48 Não se observou coincidência nos tipos de HPV encontrados nos casais, quando o resultado foi positivo para ambos, o que também foi referido em outros estudos.26,57

Também Bleeker et al., avaliando parceiros de mulheres com neoplasia intra-epitelial do colo, encontraram positividade do DNA do HPV em 67% dos raspados penianos quando havia se observado lesões à peniscopia. Quando não havia lesão peniana, esta positividade caiu para 37%.7

Outros autores, porém, que referem-se à infecção de uretra distal, comprovada pelo achado do DNA-HPV em material colhido desta região, como um fato pouco comum e consideram de pouca utilidade esta pesquisa.39

Conclusão

Embora não esteja muito clara a necessidade do exame do parceiro masculino de mulheres com infecção genital por HPV,67 assim como o benefício deste para o casal, o paciente deve ser esclarecido quanto à necessidade da sua avaliação, vantagens e desvantagens em relação ao método escolhido para isto, devendo ser motivado para tanto, pois na maioria das vezes não apresenta sintomas ou lesões e por isso recusam-se a submeter-se à propedêutica.

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